不同速度增加的單向流體剪應力調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞F-actin重組及相關(guān)研究.pdf

1、流體剪應力作用下，骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的分化趨勢及機制被越來越多關(guān)注和研究。本實驗室之前的實驗結(jié)果表明不同增加速度的單向流體剪應力同時調(diào)控了骨髓間充質(zhì)干細胞的分化方向和細胞骨架F-actin的重排。本論文以此為基礎(chǔ)，探討了不同速度增加的單向流體剪應力在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞分化過程中細胞骨架F-actin重組裝對該機制的調(diào)控作用，進一步考察了骨髓間充質(zhì)干細胞在不同增加速度的單向流體剪應力作用下力學敏感型鈣離子通道對F-actin重

2、組裝的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　以6周齡Sprague Dawley大鼠來源的第三、四代MSCs為實驗研究對象，使用平板流動腔裝置對細胞骨架固定劑鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）預處理后的 MSCs施加三種不同增加速度的單向流體剪應力,即0分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2、2分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2、20分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2（分別簡化為

3、0-0’、0-2’、0-20’）。完成20分鐘力學加載并通過熒光染色即時觀察細胞骨架F-actin聚合情況并量化其熒光強度得到細胞骨架F-actin聚合程度的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，Phalloidin抑制組的細胞連續(xù)F-actin的量化結(jié)果均大于靜態(tài)對照組，但均小于相同加載方式下而未進行預處理的實驗組，說明不同線性增加的單向流體剪應力調(diào)控了MSCs細胞骨架F-actin的重排，且0-2’加載方式使MSCs的F-actin聚合度最大，相比之下0

4、-20’力學刺激方式對細胞骨架F-actin聚合度影響最小。加載條件下Phalloidin不能完全抑制F-actin重排。
　　在發(fā)現(xiàn)上述結(jié)果后，為考察細胞骨架F-actin在不同增加速度的單向流體剪應力調(diào)控MSCs分化中的作用，本文分別檢測了MSCs的成骨向（堿性磷酸酶，ALP）和軟骨向（糖胺聚糖，GAG）分化標志物。結(jié)果表明，三種加載方式作用于MSCs20分鐘并靜態(tài)培養(yǎng)48小時后，在Phalloidin非抑制組中實驗結(jié)果與課題

5、組已得到的結(jié)論一致，即0-2’加載組的 ALP表達最多，且與其他組包括靜態(tài)組均有顯著性差異；而0-0’加載組的GAG表達結(jié)果最大，且與其他組包括靜態(tài)組均有顯著性差異。所以我們認為0-2’力學刺激可促進MSCs向成骨細胞系分化，0-0’力學刺激則可促進MSCs向軟骨細胞系分化；而Phalloidin抑制組中三種方式的力學加載組的ALP和GAG量化結(jié)果之間均沒有顯著差異性。表明不同增加速度的單向流體剪應力通過調(diào)控細胞骨架F-actin重組進

6、而影響了MSCs成骨向和軟骨向分化趨勢。為進一步探討Phalloidin試劑對MSCs分化的影響同樣使用細胞骨架F-actin穩(wěn)定劑 Phalloidin預處理 MSCs并完成三種方式力學加載，分別用含有和不含有Phalloidin的培養(yǎng)基靜態(tài)培養(yǎng)48小時后檢測細胞ALP及GAG的含量。我們發(fā)現(xiàn)在含有和不含有Phalloidin試劑的兩種靜態(tài)培養(yǎng)條件下，各加載組之間ALP和GAG量化結(jié)果并沒有差異性，說明Phalloidin試劑本身對細

7、胞ALP和GAG的表達沒有影響，同時也驗證了之前我們得到的結(jié)論，不同增加速度的單向流體剪應力通過影響細胞骨架F-actin重組進而調(diào)控了MSCs成骨向和軟骨向分化趨勢。
　　實驗室前期研究已發(fā)現(xiàn)，力學敏感型鈣離子通道與細胞骨架F-actin重排有著密切關(guān)系。但與MSCs的分化是否相關(guān)以及該通道是否通過F-actin重排調(diào)控MSCs分化尚不知曉?；诖耍覀冊诹W加載前用力學敏感型鈣離子通道阻滯劑GdCl3作用MSCs以實現(xiàn)阻滯作用

8、，20分鐘的力學加載后48小時靜態(tài)培養(yǎng)，檢測MSCs骨向和軟骨向分化標志物的表達水平。通過比較力學敏感型鈣離子通道阻滯劑作用的實驗組和未進行阻滯作用的實驗組的分化標志物的表達結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)MSCs受到不同速度增加的單向流體剪應力加載作用時，細胞骨架F-actin的響應有賴于力學敏感型鈣離子通道不同程度的開放。
　　綜合上述研究結(jié)果，不同增加速度的單向流體剪應力通過 MSCs力學敏感型鈣離子通道調(diào)控細胞骨架F-actin重組進而調(diào)控