微囊泡在介導(dǎo)急性中長波紫外線輻射“旁觀者效應(yīng)”中的作用.pdf

1、日光中紫外線所致的皮膚光損傷疾病一直是人們關(guān)注的一類熱點(diǎn)疾病。研究表明，紫外線除了引起受輻射細(xì)胞的直接損傷外，還可以通過紫外線輻射旁效應(yīng)（Ultraviolet irradiation induced bystander effects，UV-BE）引起臨近細(xì)胞的間接損傷。近年來，有關(guān)紫外線輻射旁效應(yīng)的研究，已經(jīng)覆蓋體內(nèi)外多種光損傷模型。研究者發(fā)現(xiàn)不同波段的紫外線均可產(chǎn)生多種旁觀者效應(yīng)。此外，不同劑量紫外線也可誘導(dǎo)不同強(qiáng)度的旁觀者效應(yīng)。

2、種種證據(jù)表明，紫外線輻射旁效應(yīng)可能在加劇皮膚光損傷和光致癌等重要病理過程中發(fā)揮重要作用。既往旁效應(yīng)的研究主要集中于離子輻射，盡管紫外線作為一種非離子射線，其誘發(fā)旁效應(yīng)的證據(jù)已經(jīng)建立得很充分，而這一機(jī)制發(fā)生的生化、分子機(jī)制研究目前卻剛剛起步，這一方面的研究已經(jīng)得到眾多學(xué)者的關(guān)注。
　　近年來，微囊泡(microvesicles，MVs)的功能和其攜帶的信息物質(zhì)是生物學(xué)研究一大熱點(diǎn)。研究報(bào)道受到離子輻射的細(xì)胞可向外分泌微囊泡，它是細(xì)胞

3、出芽與細(xì)胞膜融合后直接脫落形成的囊性結(jié)構(gòu)，并攜帶蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和DNA，參與細(xì)胞間的信息傳遞，介導(dǎo)旁效應(yīng)的產(chǎn)生。
　　目的：
　　觀察急性中長波紫外線輻射誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞微囊泡的生成及其對人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)，增殖活性，氧化損傷及凋亡的影響。
　　方法：
　　1.中長波紫外線輻射誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞微囊泡的生成及鑒定
　　分別采用不同劑量中長波紫外線(Ultraviolet A/Ultravi

4、olet B，UVA/UVB)輻射人皮膚成纖維細(xì)胞（human skin fibroblasts，HSF），建立急性光損傷細(xì)胞模型。本研究中采用的UVA輻射劑量為10J/cm2和20J/cm2; UVB輻射劑量為30mJ/cm2和60mJ/cm2。用特別配置的無微囊泡(microvesicles，MVs)培養(yǎng)基孵育HSF，經(jīng)上述劑量UVA和UVB輻射細(xì)胞后，于照射后0.5h、24h、48h、72h分離提取細(xì)胞上清液中的MVs。隨后使用透

5、射電鏡及光散射分析技術(shù)檢測所獲得的MVs大小及含量，BCA蛋白定量法測定各組細(xì)胞上清中MVs蛋白的含量，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting，WB)檢測MVs表面蛋白。
　　2.急性中長波紫外線輻射誘導(dǎo)生成的微囊泡對人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、氧化損害及凋亡的影響
　　采用UVA(20J/cm2)及UVB(60mJ/cm2)對HSF進(jìn)行急性輻射，收集培養(yǎng)24h后上清液中的MVs。將上述收集的MVs用PKH2

6、6染料標(biāo)記后與正常HSF共孵育，觀察HSF對MVs的攝取情況;倒置顯微鏡下觀察旁觀者細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8法及EDU染色法檢測旁觀者細(xì)胞增殖率。ROS檢測試劑盒檢測旁觀者細(xì)胞的氧化損傷，使用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測旁觀者細(xì)胞的早期凋亡，膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)/碘化丙啶(PI)雙染法流式細(xì)胞儀檢測旁觀者細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.中長波紫外線輻射誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞微囊泡的生成及鑒定
　　中長波紫

7、外線輻射誘導(dǎo)生成的MVs明顯高于正常成纖維細(xì)胞的釋放量。透射電鏡結(jié)果示MVs是一種膜性微囊結(jié)構(gòu)，圓形或橢圓形，有完整的包膜，腔內(nèi)為低電子密度成分;光散射分析技術(shù)提示紫外線輻射后誘導(dǎo)生成的MVs的直徑多聚集在150-300nm，而正常HSF分泌的MVs直徑多在120-200nm，且輻射后HSF分泌的MVs高于正常HSF所分泌的數(shù)量;BCA蛋白定量結(jié)果示，紫外線輻射后HSF上清液中MVs在輻射后24h-48h間有一個(gè)分泌高峰，而正常細(xì)胞在不

8、同時(shí)間點(diǎn)分泌MVs的數(shù)量相對恒定;WB結(jié)果提示紫外線輻射組誘導(dǎo)生成的MVs，其表面蛋白Alix、tsg101及CD9表達(dá)陽性，顯著表達(dá)Alix。
　　2急性中長波紫外線輻射誘導(dǎo)生成的微囊泡對人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、氧化損害及凋亡的影響
　　PKH26熒光標(biāo)記的MVs在加入培養(yǎng)基30min后即可被旁觀者HSF攝取，在共孵育的48h內(nèi)，細(xì)胞核周邊聚集的MVs逐漸增多。紫外線輻射誘導(dǎo)生成的MVs較正常HSF分泌的MVs被旁

9、觀者細(xì)胞攝取速度更快。旁觀者細(xì)胞與紫外線輻射誘導(dǎo)生成的MVs共孵育后，倒置顯微鏡下觀察出現(xiàn)較多的細(xì)胞碎片，細(xì)胞體積變大，過度伸展;CCK-8結(jié)果提示旁觀者HSF增殖減緩;EDU染色法提示出現(xiàn)旁觀者細(xì)胞周期阻滯，S期細(xì)胞增多;ROS結(jié)果提示，旁觀者細(xì)胞活性氧熒光強(qiáng)度高于未輻射組;線粒體膜電位結(jié)果提示旁觀者HSF表現(xiàn)為出現(xiàn)較多的細(xì)胞碎片，并出現(xiàn)較多綠色熒光，表明細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡;AV/PI雙染法結(jié)果提示旁觀者HSF表現(xiàn)出凋亡率升高;而細(xì)胞的