全反式維甲酸聯(lián)合TK基因?qū)侨饬雠杂^者效應(yīng)的研究.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤之一，其惡性程度較高，發(fā)現(xiàn)時(shí)常已有微小肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后普遍較差，而且缺乏有效的治療手段。而骨肉瘤的基因治療是最有希望的治療方法之一，在綜合治療中也是極其重要的部分。
　　其中，自殺基因（suicidegene）/前藥(prodrug)系統(tǒng)受到廣泛的重視，單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)是目前研究最多的用來評價(jià)自殺基因的治療效果。但是操作復(fù)雜，有危險(xiǎn)

2、性，故選擇經(jīng)濟(jì)、相對安全的Lipofectamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將重組質(zhì)粒pIRES-EGFP-tk成功導(dǎo)入人骨肉瘤U-2細(xì)胞中。在自殺基因系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)（Bystandereffect）更是引起腫瘤消退的重要因素，該系統(tǒng)的治療機(jī)制是通過基因轉(zhuǎn)移載體將自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，自殺基因表達(dá)蛋白，在這種蛋白作用下，在腫瘤組織局部激活本身無毒或低毒的前藥(prodrug)，將其轉(zhuǎn)化為具有高度毒性的代謝產(chǎn)物，從而將腫瘤細(xì)胞殺

3、滅。旁觀者效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是細(xì)胞縫隙連接（GJ），GJ由六個(gè)表達(dá)在細(xì)胞表面的同亞型連接蛋白（Cx）構(gòu)成的。同類細(xì)胞間的GJ傳導(dǎo)能量或信息作用最強(qiáng)，由它介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊(GJIC)可以決定細(xì)胞的正常分化和生長。Cx表達(dá)低下或位于胞漿內(nèi)時(shí)，功能性GJ就不能形成。當(dāng)GJIC功能低下時(shí)，提示細(xì)胞惡性生長、增殖或異常分化。骨肉瘤細(xì)胞中的Cx43蛋白的濃度與腫瘤細(xì)胞的分化程度成正相關(guān)，提示Cx43能影響骨肉瘤細(xì)胞的發(fā)展。
　　因此，我們可以以C

4、x43蛋白的變化來觀察plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)，plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)抗腫瘤效果不明顯，或?qū)δ承┠[瘤細(xì)胞無效的原因可能TK基因轉(zhuǎn)染效率低或旁觀者效應(yīng)低。旁觀者效應(yīng)可以通過基因轉(zhuǎn)染Cx基因或化學(xué)輔助方法來提高。據(jù)目前研究Cx基因轉(zhuǎn)染效率不是很高，所以誘導(dǎo)Cx表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)劑則應(yīng)用更廣泛。這些誘導(dǎo)劑一般對機(jī)體無毒或毒性極低，包括維甲酸、cAMP、類胡蘿卜素、糖皮質(zhì)激素等，在誘導(dǎo)Cx表達(dá)時(shí)存在細(xì)胞組織

5、特異性和Cx類型特異性。
　　全反式維甲酸作為一種良好的誘導(dǎo)劑和分化劑，與常規(guī)化療藥相比，副作用低，不良反應(yīng)較少，還能明顯的降低腫瘤的惡性程度。本實(shí)驗(yàn)我們以人骨肉瘤U-2細(xì)胞株為研究對象，全反式維甲酸作用后，觀察人骨肉瘤U-2細(xì)胞膜上Cx43蛋白含量的變化，從而觀察全反式維甲酸能否增強(qiáng)plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細(xì)胞的殺傷力和旁觀者效應(yīng)。
　　目的：
　　觀察全反式維甲酸聯(lián)合脂質(zhì)體介導(dǎo)的TK/

6、丙氧鳥苷（GCV）系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細(xì)胞旁觀者效應(yīng)的影響。
　　方法：
　　訂購重組質(zhì)粒plRES-EGFP-TK,培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U-2細(xì)胞株,熒光倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長狀態(tài),四甲基偶氮哇藍(lán)（MTT）法檢測plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細(xì)胞的生長抑制率,以及聯(lián)合ATRA與否是否增強(qiáng)其旁觀者效應(yīng),ELISE檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中連接蛋白（CX）43的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

7、　　ATRA可以抑制U-2細(xì)胞生長,當(dāng)終濃度為10-6mol/l時(shí),明顯降低細(xì)胞存活率，形態(tài)學(xué)上主要以細(xì)胞凋亡形式出現(xiàn);當(dāng)終濃度為10-7mol/l時(shí)，無抑制細(xì)胞生長作用。ATRA抑制U-2細(xì)胞生長呈濃度一時(shí)間依賴性(p<0.05)。plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細(xì)胞旁觀者效應(yīng)在TK+：TK—細(xì)胞混合比例為5:5時(shí)明顯出現(xiàn)（p＜0.05），而聯(lián)合ATRA后，在TK+:TK—細(xì)胞混合比例為3:7時(shí)就明顯出現(xiàn)（p＜0