2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、髓母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的惡性腦腫瘤,約占兒童全部腦腫瘤的20%。近年來(lái)雖然通過(guò)改良手術(shù)技術(shù),放療及化療策略在治療上取得了很大的進(jìn)步,但患兒預(yù)后仍然不是很理想。髓母細(xì)胞瘤目前最主要的治療方法是手術(shù),配合放化療。但由于腫瘤惡性程度高,生長(zhǎng)迅速,就診時(shí)往往腫瘤巨大并有腦積水,而且患者多為年齡較小的兒童,手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大。髓母細(xì)胞瘤屬于對(duì)放療敏感的腫瘤,但腫瘤細(xì)胞易隨腦脊液播散,故放射治療時(shí)要做全腦全脊髓放療,放療劑量大,對(duì)兒童損傷大?;熥鳛橐环N輔

2、助的手段,對(duì)兒童毒、副作用嚴(yán)重。髓母細(xì)胞瘤預(yù)后極差。
   基因療法是近年來(lái)興起的新治療手段,具有非常廣闊的前景。然而,由于基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞效率低等原因,基因治療目前難以取得很好的療效。增強(qiáng)“旁觀者效應(yīng)”(bystander effect,BE)可以為我們提供了一個(gè)更好的途徑來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題?!芭杂^者效應(yīng)”是指加入前藥后,與導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞相鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞也被殺死的現(xiàn)象,其明顯擴(kuò)大了自殺基因的殺傷作用。目前許多

3、報(bào)道認(rèn)為旁觀者效應(yīng)與連接素43(Cx43)和細(xì)胞間縫隙連接通訊(GJIC)有關(guān)。
   Cx43是一種主要的細(xì)胞間隙連接蛋白,在多種正常組織細(xì)胞中表達(dá)。Cx43表達(dá)減少或缺失與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān),特別是與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系極為密切。相鄰細(xì)胞間通過(guò)間隙連接所介導(dǎo)的間隙連接通訊(GJIC)進(jìn)行細(xì)胞間信息和能量交換,對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化起著重要的調(diào)控作用。在多種腫瘤組織中GJIC功能明顯下降。

4、r>   增加Cx43蛋白表達(dá)和GJIC功能能夠增強(qiáng)旁觀者效應(yīng)。相對(duì)于基因轉(zhuǎn)染,化學(xué)誘導(dǎo)的Cx43蛋白增加可以影響到更多的癌細(xì)胞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多種類的化學(xué)藥物諸如類視黃醇、cAMP、類胡蘿卜素等都可以增加細(xì)胞Cx43的表達(dá)量,增強(qiáng)GJIC功能。另有研究發(fā)現(xiàn)將Cx43轉(zhuǎn)染進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,隨著Cx43蛋白表達(dá)的增加,細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性也增加了。因此,找到某種化學(xué)物質(zhì)能夠提高旁觀者效應(yīng)又能提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性對(duì)于髓母細(xì)胞瘤的

5、治療是非常有意義的。
   在本研究中,我們用含有HSV-tk基因的小鼠成纖維細(xì)胞株P(guān)A317病毒上清轉(zhuǎn)染人髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞,構(gòu)建HSV-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)。然后以db-cAMP處理Daoy細(xì)胞,通過(guò)Western Blot檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá),以劃痕標(biāo)記染料示蹤實(shí)驗(yàn)(scrape-loading and dye transfer,SLDT)檢測(cè)了GJIC功能,以MTT法檢查了旁觀者效應(yīng)及細(xì)胞對(duì)化療藥物替莫唑胺(

6、temozolomide,TMZ)和替尼泊苷(teniposide,VM-26)的敏感性。為探討機(jī)理,又用Western Blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)。通過(guò)棉子酚的反向作用探討了db-cAMP的具體作用機(jī)制。
   材料與方法:
   1、人髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞和PA317細(xì)胞的培養(yǎng)
   含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,在37℃,濕度100%,5%CO2條件的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周傳代兩次。

7、   2、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Daoy細(xì)胞
   將PA317細(xì)胞接種在75cm2培養(yǎng)瓶中,高糖DMEM加10%滅活FCS培養(yǎng)。接種24-48h后,收集上清液,濾過(guò)后儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?。然后以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Daoy細(xì)胞。首先,將一百萬(wàn)傳代Daoy細(xì)胞接種在75cm2培養(yǎng)皿中,24h后,將儲(chǔ)存的含有病毒載體的細(xì)胞上清液加入終濃度為4μg/ml Polybrene,再加入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h。處理后的細(xì)胞以150μg/ml G41

8、8篩選兩周,用間接免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。G418篩選處理后的細(xì)胞,兩周后得到穩(wěn)定細(xì)胞株Daoy-tk。
   3、用間接免疫熒光法檢測(cè)HSV-tk基因在Daoy細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
   4、用RT-PCR法檢測(cè)HSV-tk基因是否存在,判斷是否基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)Daoy細(xì)胞中。
   5、用MTT法檢測(cè)db-cAMP和GCV對(duì)Daoy細(xì)胞存活率是否有協(xié)調(diào)作用。
   6、用Western blot法檢測(cè)Bc

9、l-2蛋白在db-cAMP處理組和未處理組中的變化。檢測(cè)了Cx43蛋白單用db-cAMP處理組;和先用db-cAMP,后用棉子酚處理組:db-cAMP未處理組中的變化。
   7、用劃痕標(biāo)記染料示蹤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的GJIC功能的變化
   8、用MTT法檢測(cè)不同處理組的旁觀者效應(yīng)的變化。
   9、用MTT法檢測(cè)db-cAMP處理組和未處理組中的細(xì)胞對(duì)替莫唑胺和替尼泊苷敏感性的變化。
   結(jié)果:

10、
   1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Daoy細(xì)胞成功,獲得穩(wěn)定的Daoy-tk細(xì)胞株。
   2、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染含HSV-tk基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體于Daoy細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染效果較好,Daoy-tk細(xì)胞在視野清晰可見(jiàn)。
   3、通過(guò)RT-PCR方法驗(yàn)證,HSV-tk基因在Daoy細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
   4、db-cAMP處理與未經(jīng)db-cAMP處理的Daoy細(xì)胞相比較,無(wú)論是處理24小時(shí)或是72小時(shí),給予G

11、CV處理后兩者存活率無(wú)顯著性差別。
   5、db-cAMP(0.5mM)以濃度依賴性方式顯著增加Cx43蛋白及磷酸化形式蛋白的表達(dá)。當(dāng)db-cAMP濃度為0.5mM時(shí),細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞增加了近2倍;當(dāng)db-cAMP濃度增加為1mM和1.5mM時(shí),Cx43蛋白表達(dá)量增加了近3倍。經(jīng)db-cAMP處理的Daoy細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量相對(duì)于正常細(xì)胞顯著降低。
   6、db-cAMP可以顯著增強(qiáng)Dao

12、y細(xì)胞GJIC功能,隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,瑩黃在經(jīng)db-cAMP處理的細(xì)胞中彌散的速度快于其他兩組細(xì)胞,差距隨時(shí)間增大。
   7、在tk+/tk-細(xì)胞比率為20:1-2-5:1時(shí),經(jīng)db-cAMP處理組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞生存率顯著降低;當(dāng)k+/tk-細(xì)胞比率降至2-5:1,處理組中仍可以觀察到比較明顯的旁觀者效應(yīng),但在未經(jīng)db-cAMP處理細(xì)胞中,比率升至2-2:1時(shí)才可以觀察到比較明顯的旁觀者效應(yīng)。
   8、db-cAM

13、P可以明顯增強(qiáng)TMZ和VM26兩種化療藥物對(duì)Daoy細(xì)胞的細(xì)胞毒性。Daoy細(xì)胞經(jīng)db-cAMP處理后,TMZ和VM26兩種藥物IC50值顯著降低;與未處理對(duì)照細(xì)胞相比,db-cAMP處理的TMZ細(xì)胞毒性是對(duì)照細(xì)胞的3倍,VM26是對(duì)照細(xì)胞的2倍。
   結(jié)論:
   1、在人髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)入HSV-tk基因,形成穩(wěn)定Daoy-tk細(xì)胞株。經(jīng)免疫熒光法檢測(cè)和RT-PCR實(shí)驗(yàn),證實(shí)了Daoy-tk細(xì)胞株中t

14、k基因的存在。
   2、db-cAMP能明顯增強(qiáng)Daoy細(xì)胞中自殺基因治療的旁觀者效應(yīng),棉子酚可對(duì)抗此增強(qiáng)效應(yīng)。
   3、db-cAMP是強(qiáng)力分化誘導(dǎo)子,具有抗增值的效果,GCV是基因治療中的“前藥”,二者對(duì)Daoy細(xì)胞無(wú)協(xié)同作用。
   4、db-cAMP顯著上調(diào)Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白的表達(dá),而棉子酚顯著下調(diào)Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白。
   5、db-cAMP顯著增強(qiáng)GJIC功能,

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