新型自殺基因Linamarase-Linamarin系統(tǒng)對(duì)肝癌體外殺傷效應(yīng)及其旁觀者效應(yīng)的初步觀察研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在建立能夠穩(wěn)定表達(dá)外緣基因linamarase的HepG2/lis和SMMC/lis肝癌細(xì)胞株，進(jìn)而研究新型自殺基因lis/lin系統(tǒng)對(duì)肝癌的體外殺傷效應(yīng)及旁觀者效應(yīng)。
　　方法：
　　1、通過(guò)電穿孔法將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-lis和質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC7721中，通過(guò)G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得HepG2/lis、HepG2/EGFP、S

2、MMC/lis和SMMC/EGFP細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，RT-PCR法進(jìn)行表達(dá)鑒定。
　　2、繪制基因修飾細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性有無(wú)改變；MTT法觀察高濃度lin對(duì)正常肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721的細(xì)胞毒性；MTT法觀察不同濃度下lin在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2/lis、HepG2/EGFP、SMMC/lis和SMMC/EGFP的細(xì)胞毒性。
　　3、通過(guò)將不同比例的基因修飾細(xì)胞和正常細(xì)胞相混合，給與li

3、n作用后，觀察lis/lin自殺基因系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1、成功獲得穩(wěn)定表達(dá)lis基因的HepG2/lis和SMMC/lis細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察有明顯的lis-EGFP融合蛋白表達(dá)，RT-PCR鑒定證明lis基因在mRNA水平有明顯表達(dá)。
　　2、通過(guò)比較基因修飾細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，證明lis基因?qū)?xì)胞的增殖生長(zhǎng)沒(méi)有影響；高濃度的lin對(duì)未進(jìn)行基因修飾的肝癌細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性；低濃度lin對(duì)HepG2/li

4、s及SMMC/lis細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用，即lin（100～1000mg/L）處理HepG2/lis和SMMC/lis細(xì)胞2～4天，可殺死大部分細(xì)胞。
　　3、旁觀者效應(yīng)研究顯示僅10％左右的HepG2/lis細(xì)胞與HepG2細(xì)胞混合培養(yǎng)于lin濃度為500mg/L的培養(yǎng)基時(shí)，即可殺死幾乎全部的細(xì)胞，顯示出強(qiáng)大的旁觀者效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1、lis/lin自殺基因系統(tǒng)在體外對(duì)肝癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用。