鈦材表面生物功能化及其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類來源于骨髓的多能干細(xì)胞，能被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞或者成軟骨細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于骨組織工程和骨外科領(lǐng)域。MSCs對(duì)其賴以生存的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）微環(huán)境極其敏感，能快速而精確地響應(yīng)ECM給予的任何生物物理和生物化學(xué)刺激。ECM的些許變化都有可能改變MSCs的命運(yùn)。因此，如何優(yōu)化材料設(shè)計(jì)并誘導(dǎo)MSCs向成骨系細(xì)胞分化，實(shí)現(xiàn)骨組織再生和重建，已成為骨科相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。鈦及鈦合金是臨床上廣泛應(yīng)用的骨修復(fù)材料。

2、然而，鈦及鈦合金材料表面的二氧化鈦氧化層具有生物惰性，缺乏誘導(dǎo)骨生成潛能，導(dǎo)致鈦基植入體與周邊自然骨組織的整合性差，使用壽命短。鈦基植入體植入體內(nèi)后，生長(zhǎng)在材料表面并促進(jìn)新骨生成的成骨細(xì)胞大多來自于MSCs。鑒于此，為提高鈦基植入體的骨整合性能，亟需發(fā)展提高鈦基材表面生物活性的方法，以誘導(dǎo) MSCs的成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)骨組織生成和加速植入體與周圍骨組織的整合。
　　本論文從仿生自然骨微納結(jié)構(gòu)角度出發(fā)，利用簡(jiǎn)單的堿熱處理技術(shù)、離子交

3、換技術(shù)和硅烷化等方法制備了具有高效生物活性表面的鈦基材，提供 MSCs適宜的生物物理和/或生物化學(xué)刺激，誘導(dǎo)MSCs的成骨分化，進(jìn)而提高鈦基材表面的新骨生成能力和骨整合性。本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　　1.納米片功能化鈦材對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的影響
　　為探究生物物理刺激對(duì) MSCs成骨分化行為的影響，本章利用簡(jiǎn)單的堿熱和稀酸處理，在純鈦表面制備了均勻規(guī)整的由TiO2納米片組成的亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。通過場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡、原

4、子力電鏡、X光電子能譜、X射線衍射儀和接觸角測(cè)試對(duì)表面特性進(jìn)行表征。利用牛血清白蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著TiO2納米片尺寸的增大，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)化鈦材對(duì)蛋白吸附的吸附能力顯著增加。此外，通過四唑鹽比色檢測(cè)，粘著斑蛋白染色，堿性磷酸酶（ALP）染色，茜素紅染色，細(xì)胞礦化鈣生成量測(cè)定，成骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子Runx2、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Osterix、ALP、I型膠原蛋白（Col I）、骨鈣素（OCN）和骨橋蛋白（OPN）在mRNA水平

5、上的表達(dá)以及Runx2、Col I和OPN蛋白表達(dá)水平等實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞與分子水平上分別探究了表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材對(duì) MSCs的粘附、鋪展、增殖及分化的影響。結(jié)果表明，TiO2納米片組成的亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯著地促進(jìn)了 MSCs的粘附、增殖及成骨分化。本研究提供了一種制備表面亞微米復(fù)合拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)化鈦基植入體的新方法。
　　2.含鍶納米片功能化鈦材協(xié)同促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化及體內(nèi)成骨的研究
　　為探究生物物理和生物化學(xué)刺激對(duì) MSCs行

6、為的協(xié)同影響，我們采用離子交換技術(shù)改變了 TiO2納米片組成的亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的化學(xué)元素，將生物活性 Sr2+巧妙地引入到拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中，制備了含鍶納米片功能化鈦材。通過場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡、X射線能譜儀、X光電子能譜、原子力電鏡、X射線衍射儀及接觸角測(cè)量對(duì)材料表面物理和化學(xué)特征進(jìn)行表征。在不改變亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，成功地將 Sr2+引入到鈦材表面。然后，通過四唑鹽比色檢測(cè)，粘著斑蛋白染色，ALP染色，茜素紅染色，細(xì)胞礦化鈣生成量測(cè)定以及Ru

7、nx2、Osterix、ALP、Col I、OCN和OPN在mRNA水平上的表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞和分子水平考察了引入Sr2+離子的亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì) MSCs成骨分化的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果表明，一方面，含鍶納米片功能化鈦材通過亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)給予 MSCs強(qiáng)烈的生物物理刺激，增強(qiáng)粘著斑復(fù)合物的形成和成熟，從而誘導(dǎo)MSCs向成骨系分化；另一方面，從結(jié)構(gòu)中釋放的Sr2+，在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)地給予 MSCs生物化學(xué)刺激，加速 MSCs的成骨分化。最后，將未

8、處理的、亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的與引入Sr2+離子的亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)化的鈦棒分別植入到成熟新西蘭兔子的股骨骨端，經(jīng)過4和12周后，進(jìn)行X光片，Micro-CT掃描及蘇木精伊紅和 masson’s三色染色組織學(xué)分析，評(píng)價(jià)Sr2+離子和亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在體內(nèi)協(xié)同促進(jìn)新骨生成的能力。體內(nèi)植入結(jié)果表明，引入了Sr2+離子的亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)協(xié)同地促進(jìn)了植入體的新骨生成，從而提高了植入體與周圍骨組織的整合能力。本研究為研發(fā)高質(zhì)量的具有優(yōu)良骨整合性的鈦植入體提供了

9、新方法。
　　3.葉酸鍶螯合物功能化鈦材對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響的研究
　　為賦予生物功能化鈦材長(zhǎng)時(shí)間刺激 MSCs的能力，本研究利用硅烷化和共價(jià)接枝的方法將葉酸鍶螯合物固定到鈦材表面，制備了葉酸鍶螯合物功能化鈦材。通過場(chǎng)發(fā)射電鏡、原子力電鏡、X光電子譜與接觸角測(cè)量對(duì)表面特性進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，葉酸鍶螯合物已成功地固定到堿熱處理的鈦材表面，鍶元素的含量達(dá)到3.11％。然后，通過CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)，細(xì)胞骨架染色，AL