鈦材表面生物功能化及其對骨髓間充質(zhì)干細胞的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）是一類來源于骨髓的多能干細胞，能被誘導(dǎo)分化為成骨細胞或者成軟骨細胞，廣泛應(yīng)用于骨組織工程和骨外科領(lǐng)域。MSCs對其賴以生存的細胞外基質(zhì)（ECM）微環(huán)境極其敏感，能快速而精確地響應(yīng)ECM給予的任何生物物理和生物化學(xué)刺激。ECM的些許變化都有可能改變MSCs的命運。因此，如何優(yōu)化材料設(shè)計并誘導(dǎo)MSCs向成骨系細胞分化，實現(xiàn)骨組織再生和重建，已成為骨科相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點之一。鈦及鈦合金是臨床上廣泛應(yīng)用的骨修復(fù)材料。

2、然而，鈦及鈦合金材料表面的二氧化鈦氧化層具有生物惰性，缺乏誘導(dǎo)骨生成潛能，導(dǎo)致鈦基植入體與周邊自然骨組織的整合性差，使用壽命短。鈦基植入體植入體內(nèi)后，生長在材料表面并促進新骨生成的成骨細胞大多來自于MSCs。鑒于此，為提高鈦基植入體的骨整合性能，亟需發(fā)展提高鈦基材表面生物活性的方法，以誘導(dǎo) MSCs的成骨分化，進而促進骨組織生成和加速植入體與周圍骨組織的整合。
　　本論文從仿生自然骨微納結(jié)構(gòu)角度出發(fā)，利用簡單的堿熱處理技術(shù)、離子交

3、換技術(shù)和硅烷化等方法制備了具有高效生物活性表面的鈦基材，提供 MSCs適宜的生物物理和/或生物化學(xué)刺激，誘導(dǎo)MSCs的成骨分化，進而提高鈦基材表面的新骨生成能力和骨整合性。本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　1.納米片功能化鈦材對骨髓間充質(zhì)干細胞行為的影響
　　為探究生物物理刺激對 MSCs成骨分化行為的影響，本章利用簡單的堿熱和稀酸處理，在純鈦表面制備了均勻規(guī)整的由TiO2納米片組成的亞微米拓撲結(jié)構(gòu)。通過場發(fā)射掃描電鏡、原

4、子力電鏡、X光電子能譜、X射線衍射儀和接觸角測試對表面特性進行表征。利用牛血清白蛋白進行蛋白質(zhì)吸附實驗，結(jié)果表明，隨著TiO2納米片尺寸的增大，拓撲結(jié)構(gòu)化鈦材對蛋白吸附的吸附能力顯著增加。此外，通過四唑鹽比色檢測，粘著斑蛋白染色，堿性磷酸酶（ALP）染色，茜素紅染色，細胞礦化鈣生成量測定，成骨細胞特異轉(zhuǎn)錄因子Runx2、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Osterix、ALP、I型膠原蛋白（Col I）、骨鈣素（OCN）和骨橋蛋白（OPN）在mRNA水平

5、上的表達以及Runx2、Col I和OPN蛋白表達水平等實驗，在細胞與分子水平上分別探究了表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材對 MSCs的粘附、鋪展、增殖及分化的影響。結(jié)果表明，TiO2納米片組成的亞微米拓撲結(jié)構(gòu)顯著地促進了 MSCs的粘附、增殖及成骨分化。本研究提供了一種制備表面亞微米復(fù)合拓撲結(jié)構(gòu)化鈦基植入體的新方法。
　　2.含鍶納米片功能化鈦材協(xié)同促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化及體內(nèi)成骨的研究
　　為探究生物物理和生物化學(xué)刺激對 MSCs行

6、為的協(xié)同影響，我們采用離子交換技術(shù)改變了 TiO2納米片組成的亞微米拓撲結(jié)構(gòu)中的化學(xué)元素，將生物活性 Sr2+巧妙地引入到拓撲結(jié)構(gòu)中，制備了含鍶納米片功能化鈦材。通過場發(fā)射掃描電鏡、X射線能譜儀、X光電子能譜、原子力電鏡、X射線衍射儀及接觸角測量對材料表面物理和化學(xué)特征進行表征。在不改變亞微米拓撲結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，成功地將 Sr2+引入到鈦材表面。然后，通過四唑鹽比色檢測，粘著斑蛋白染色，ALP染色，茜素紅染色，細胞礦化鈣生成量測定以及Ru

7、nx2、Osterix、ALP、Col I、OCN和OPN在mRNA水平上的表達等實驗，從細胞和分子水平考察了引入Sr2+離子的亞微米拓撲結(jié)構(gòu)對 MSCs成骨分化的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果表明，一方面，含鍶納米片功能化鈦材通過亞微米拓撲結(jié)構(gòu)給予 MSCs強烈的生物物理刺激，增強粘著斑復(fù)合物的形成和成熟，從而誘導(dǎo)MSCs向成骨系分化；另一方面，從結(jié)構(gòu)中釋放的Sr2+，在一定時間內(nèi)持續(xù)地給予 MSCs生物化學(xué)刺激，加速 MSCs的成骨分化。最后，將未

8、處理的、亞微米拓撲結(jié)構(gòu)的與引入Sr2+離子的亞微米拓撲結(jié)構(gòu)化的鈦棒分別植入到成熟新西蘭兔子的股骨骨端，經(jīng)過4和12周后，進行X光片，Micro-CT掃描及蘇木精伊紅和 masson’s三色染色組織學(xué)分析，評價Sr2+離子和亞微米拓撲結(jié)構(gòu)在體內(nèi)協(xié)同促進新骨生成的能力。體內(nèi)植入結(jié)果表明，引入了Sr2+離子的亞微米拓撲結(jié)構(gòu)協(xié)同地促進了植入體的新骨生成，從而提高了植入體與周圍骨組織的整合能力。本研究為研發(fā)高質(zhì)量的具有優(yōu)良骨整合性的鈦植入體提供了

9、新方法。
　　3.葉酸鍶螯合物功能化鈦材對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化影響的研究
　　為賦予生物功能化鈦材長時間刺激 MSCs的能力，本研究利用硅烷化和共價接枝的方法將葉酸鍶螯合物固定到鈦材表面，制備了葉酸鍶螯合物功能化鈦材。通過場發(fā)射電鏡、原子力電鏡、X光電子譜與接觸角測量對表面特性進行表征。結(jié)果顯示，葉酸鍶螯合物已成功地固定到堿熱處理的鈦材表面，鍶元素的含量達到3.11％。然后，通過CCK-8細胞活性檢測，細胞骨架染色，AL