骨橋蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移的影響及其分子機(jī)理.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有多向分化潛能。在不同培養(yǎng)條件下，MSCs能分化成為多種細(xì)胞。越來(lái)越多的證據(jù)表明，MSCs具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。除了易于分離獲取、體外增殖潛力巨大和不涉及倫理問(wèn)題這些優(yōu)勢(shì)外，MSCs還具有趨化特性。趨向受損部位的定向遷移已經(jīng)成為MSCs臨床應(yīng)用研究的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在不同的組織細(xì)胞中均有所發(fā)現(xiàn)。

2、當(dāng)機(jī)體各部位受到損傷時(shí)，損傷部位的OPN表達(dá)升高。OPN表達(dá)的升高不僅能增加多種細(xì)胞的遷移能力，同時(shí)也能介導(dǎo)細(xì)胞定向遷移。
　　迄今為止，OPN在MSCs定向遷移過(guò)程中的作用還未引起研究者的足夠重視，相關(guān)的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，其分子機(jī)理更不明了。因此，本文試圖揭示外源OPN在大鼠MSCs(ratMSCs,rMSCs)定向遷移過(guò)程中的作用及其分子機(jī)理。該研究工作的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.rMSCs的原代分離培養(yǎng)及鑒定

3、　　利用1.073g/ml的Percoll密度梯度離心法和rMSCs貼壁特性，體外分離培養(yǎng)rMSCs。結(jié)果表明，原代細(xì)胞14天左右達(dá)到85％融合。傳代后的細(xì)胞貼壁時(shí)間約為半小時(shí)。細(xì)胞24h內(nèi)即可完全伸展，呈纖維狀。傳代細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，4~6天達(dá)到80%~90%融合，并形成漩渦樣單層，細(xì)胞形態(tài)趨于一致。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離得到的細(xì)胞表達(dá)CD44和CD90，但不表達(dá)CD34，符合MSCs表面標(biāo)記抗原的一般規(guī)律。
　　2.OPN促r

4、MSCs定向遷移
　　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPN是否能夠誘導(dǎo)rMSCs定向遷移。結(jié)果表明，OPN具有促rMSCs定向遷移的能力，并且OPN促rMSCs定向遷移的能力與OPN的濃度呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。
　　3.Integrinβ1介導(dǎo)OPN促rMSCs遷移
　　為檢測(cè)在遷移過(guò)程中，OPN是否能改變細(xì)胞CD44v6或integrinβ1mRNA的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)OPN(1μg/ml)作用rMSCs后，mR

5、NA的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，OPN能使integrinβ1mRNA的表達(dá)水平增加(1.5倍，p<0.01)。但CD44v6mRNA的表達(dá)情況卻沒(méi)有明顯改變。另外，western蛋白印跡表明，OPN作用2.0h以后，integrinβ1的蛋白表達(dá)開(kāi)始上升；4.0h，達(dá)到峰值(1.3倍，p<0.05)；6.0h以后，integrinβ1的蛋白表達(dá)開(kāi)始下調(diào)，但依舊高于對(duì)照組。阻斷integrinβ1受體后，OPN促rMSCs定向遷移的能力受

6、到抑制。提示，OPN能夠增加rMSCs中integrinβ1的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面integrinβ1受體，促進(jìn)rMSCs定向遷移。
　　4.黏著斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedkinase,ERK)信號(hào)通路介導(dǎo)OPN促rMSCs定向遷移
　　Western蛋白印跡檢測(cè)OPN(1μg/ml)作用rMSCs后，磷酸化FAK

7、(phospho-FAK,pFAK)和磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2,pERK1/2)的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，OPN作用條件下0.5h，pFAK的表達(dá)量升高(1.3倍，p<0.05)，F(xiàn)AK信號(hào)通路被激活；pERK1/2在OPN作用0.5h時(shí)，表達(dá)升高(1.7倍，p<0.05)，1.0h，達(dá)到峰值(2.8倍，p<0.01)，2.0h有所回落(1.3倍，p<0.05)，4.0h后與對(duì)照組相比沒(méi)差異。抑制劑阻斷OPN激活

8、ERK和FAK信號(hào)通路以后，OPN促rMSCs定向遷移的能力受到抑制。另外，integrinβ1抗體可有效抑制OPN升高pFAK和pERK1/2表達(dá)的作用，阻斷FAK/ERK信號(hào)通路的激活。提示，OPN結(jié)合integrinβ1受體以后，通過(guò)激活FAK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)rMSCs定向遷移。
　　5.OPN改變r(jià)MSCs的力學(xué)性質(zhì)
　　原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)檢測(cè)OPN(1μg/ml

9、)作用后，rMSCs楊氏模量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPN可以顯著降低rMSCs的楊氏模量(p<0.05)。另外，阻斷integrinβ1受體，抑或阻斷FAK/ERK信號(hào)分子的激活均能抑制OPN降低細(xì)胞楊氏模量的作用。結(jié)果表明，rMSCs的遷移能力與其細(xì)胞硬度密切相關(guān)。
　　本文的研究結(jié)果表明，OPN可以通過(guò)上調(diào)integrinβ1的表達(dá)，激活FAK/ERK信號(hào)通路，降低rMSCs的細(xì)胞硬度，從而促進(jìn)rMSCs定向遷移。結(jié)果提示，機(jī)體受