骨髓間充質(zhì)干細胞對阿霉素損傷足細胞mTOR的影響.pdf

1、目的：
　　探討大鼠BMSCs對阿霉素損傷足細胞mTOR的影響。
　　方法：
　　1、利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁分離法從SD大鼠骨髓中提取BMSCs，經(jīng)體外傳代、擴增至P3，并利用流式細胞儀鑒定其表面標志物CD29、CD34、CD45、CD90，同時運用成軟骨和成脂誘導方法鑒定其功能。
　　2、利用過篩法和IV型膠原酶消化法從SD大鼠腎臟中提取足細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)，并通過免疫熒光法檢測其表面特有的蛋白nephrin

2、和podocin對其進行鑒定。
　　3、體外實驗，分為：正常組足細胞；阿霉素組足細胞+阿霉素(2ug/ml)；干細胞組足細胞+BMSCs（共培養(yǎng)24h）+阿霉素(2ug/ml)。各實驗組干預0h、3h、24h后利用Western bolt技術(shù)檢測各組足細胞骨架相關(guān)蛋白nephrin及mTOR信號通路相關(guān)蛋白mTOR、p-mTOR、raptor、rictor的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、顯微鏡下觀察BMSCs呈梭形、

3、多角形成纖維細胞樣形態(tài)，大小基本一致。BMSCs在分別加入成軟骨和成脂誘導劑下成功誘導出成軟骨細胞和脂肪細胞。利用流式細胞儀檢測BMSCs表面的抗原標志物提示CD29、CD90呈強陽性，CD34和CD45呈陰性表達。細胞純度可達98％以上。
　　2、利用過篩法可以成功分離出腎小球，用IV型膠原酶消化后種植在培養(yǎng)瓶中能從腎小球中爬出成鵝卵石樣細胞，利用免疫熒光法檢測其表面可以表達出足細胞特有的蛋白nephrin和podocin。

4、r>　　3、Western bolt結(jié)果顯示：在0小時和3小時時，正常組、阿霉素組、干細胞組nephrin和rictor的表達無明顯差異;在24小時時，干細胞組和阿霉素組的nephrin的表達均比正常組少，但干細胞組比阿霉素組的表達多，同時干細胞組和阿霉素組的rictor的表達均比正常組多，但干細胞組比阿霉素組的表達少。mTOR、p-mTOR、raptor蛋白在0小時時，正常組、阿霉素組、干細胞組的表達無明顯差異，但是在3小時、24小時

5、時，干細胞組和阿霉素組的表達均比正常組多，但干細胞組比阿霉素組的表達少，且24小時時的表達量均大于3小時時的表達量。
　　結(jié)論：
　　1、利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法能成功提取、培養(yǎng)出BMSCs，并且其純度高、活性高、增殖能力強及多向分化潛能，可用于實驗研究。
　　2、利用過篩法和IV型膠原酶消化法能成功提取、培養(yǎng)出符合實驗要求的足細胞。
　　3、AMD足細胞的損傷機制與足細胞mTOR過度激活有關(guān)，從而導致足