中藥甲亢寧膠囊對FRTL-5細胞TSHR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　1.探討甲亢寧對TSHR胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　2.探討甲亢寧治療甲亢的作用機制與促進細胞凋亡的關(guān)聯(lián)性。
　　方法:
　　1.我們采用MTT法檢測了甲亢寧的不同濃度及作用時間對FRTL-5細胞的影響，探索甲亢寧的量效和時效關(guān)系，從而確定甲亢寧的濃度及作用時間。
　　2.我們采用熒光倒置顯微鏡觀察經(jīng)過甲亢寧干預(yù)后FRTL-5細胞的形態(tài)，并采用CCK-8法檢測甲亢寧干預(yù)后FRTL-5細胞增殖的

2、情況。
　　3.我們采用流式細胞技術(shù)檢測了甲亢寧對FRTL-5細胞凋亡的影響。
　　4.我們采用放免法檢測甲亢寧干預(yù)后FRTL-5細胞上清液中cAMP的含量。
　　5.我們采用Western Blot檢測了甲亢寧干預(yù)后FRTL-5細胞TSHR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.甲亢寧的量效和時效關(guān)系
　　甲亢寧具有抑制細胞增殖的作用，而且隨著濃度的增加、時間的延長，其抑制作用越強。甲巰咪

3、唑則無抑制細胞增殖的作用。由此我們選定甲亢寧和甲巰咪唑的濃度和作用時間為3mg/ml甲亢寧、10ug/ml甲巰咪唑，作用時間為24h。
　　2.甲亢寧對FRTL-5細胞增殖的影響
　?、偌卓簩幾饔糜贔RTL-5細胞形態(tài)學(xué)觀察:基線組細胞數(shù)量少;體積略小;培養(yǎng)液中漂浮有細胞碎片。模型組細胞數(shù)量明顯增多;細胞體積大，細胞輪廓清晰，形態(tài)飽滿;可見偽足樣胞質(zhì)突起;胞漿內(nèi)可見黑色點狀顆粒;高倍鏡下清晰可見細胞核，核漿比大，細胞核為圓形

4、，可以見到核仁。甲亢寧組細胞數(shù)量明顯減少，細胞固縮，體積變小;胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡;不能清晰的分辨出細胞核和核仁。甲巰咪唑組細胞數(shù)量明顯多;細胞體積大，細胞輪廓清晰，形態(tài)飽滿;可見偽足樣胞質(zhì)突起;胞漿內(nèi)可見黑色點狀顆粒;高倍鏡下清晰可見細胞核，核漿比大，細胞核為圓形，可以見到核仁。
　　②甲亢寧對FRTL-5細胞增殖的影響:采用CCK-8法檢測了各組FRTL-5細胞的OD值，模型組(1.76±0.22)明顯高于基線組(0.41±0.04

5、)，P＜0.01;甲亢寧組(0.12±0.01)低于模型組(1.76±0.22)，P＜0.01;甲亢寧組(0.12±0.01)低于甲巰咪唑組(1.45±0.26)，P＜0.01;甲巰咪唑組與模型組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.甲亢寧對FRTL-5細胞凋亡的影響
　　采用流式細胞技術(shù)檢測了各組FRTL-5細胞的凋亡率，根據(jù)試劑盒中熒光染料與細胞的結(jié)合部位不同，可以將調(diào)亡分為早期凋亡及中晚期調(diào)亡。在細胞的早期凋亡

6、率中，模型組(1.52±0.34)低于基線組(3.97±0.62)，P＜0.01;甲亢寧組(14.55±1.80)明顯高于模型組(1.52±0.34)，P＜0.01;甲亢寧組(14.55±1.80)高于甲巰咪唑組(2.14±0.68)，P＜0.01;甲巰咪唑組與模型組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在細胞的中晚期凋亡率中，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在細胞總凋亡率中，甲亢寧組(35.63±8.70)明顯高于模型組(10.28±2.52

7、)、甲巰咪唑組(9.05±1.96)，P＜0.01;甲巰咪唑組與模型組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.甲亢寧對FRTL-5細胞cAMP釋放量的影響
　　采用放免法檢測了各組FRTL-5細胞上清液中cAMP的含量，模型組為(2.80±0.13 pmol/ml)高于基線組(1.88±0.09 pmol/ml)，P＜0.01;甲亢寧組為(2.54±0.10 pmol/ml)低于模型組(2.80±0.13 pmol/m

8、l)，P＜0.05;甲亢寧組為(2.54±0.10 pmol/ml)低于甲巰咪唑組(2.79±0.07 pmol/ml)，P＜0.05;甲巰咪唑組與模型組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.甲亢寧對FRTL-5細胞TSHR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　?、偌卓簩帉RTL-5細胞PKAc蛋白表達的影響:采用Western Blot檢測了各組FRTL-5細胞p-PKAc/PKAc蛋白表達，模型組(0.91±0.03)明顯高于

9、基線組(0.43±0.15)，P＜0.01;甲亢寧組(0.56±0.10)低于模型組(0.91±0.03)，P＜0.01;甲巰咪唑組(0.60±0.14)低于模型組(0.91±0.03) P＜0.05。
　?、诩卓簩帉RTL-5細胞Erk1/2蛋白表達的影響:采用Western Blot檢測了各組FRTL-5細胞p-Erk1/2/Erk1/2蛋白表達，模型組(0.86±0.05)明顯高于基線組(0.36±0.17)，P＜0.01

10、;甲亢寧組(0.28±0.13)明顯低于模型組(0.86±0.05)，P＜0.01;甲亢寧組(0.28±0.13)低于甲巰咪唑組(0.82±0.07)，P＜0.01;甲巰咪唑組與模型組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　③甲亢寧對FRTL-5細胞PKCδ蛋白表達的影響:采用Western Blot檢測了各組FRTL-5細胞p-PKCδ/PKCδ蛋白表達，模型組(0.88±0.13)明顯高于基線組(0.47±0.33)，P＜0

11、.01;甲亢寧組(0.56±0.16)低于模型組(0.88±0.13)，P＜0.05;甲巰咪唑組與模型組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　?、芗卓簩帉RTL-5細胞Akt蛋白表達的影響:采用Western Blot檢測了各組FRTL-5細胞p-Akt/Akt蛋白表達，模型組(0.73±0.12)明顯高于基線組(0.30±0.12)，P＜0.01;甲亢寧組(0.30±0.12)明顯低于模型組(0.73±0.12)，P＜0.0

12、1;甲亢寧組(0.30±0.12)低于甲巰咪唑組(0.68±0.13)，P＜0.01;甲巰咪唑組與模型組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　?、菁卓簩帉RTL-5細胞mTOR蛋白表達的影響:采用Western Blot檢測了各組FRTL-5細胞p-Akt/Akt蛋白表達，模型組(0.75±0.08)明顯高于基線組(0.26±0.16)，P＜0.01;甲亢寧組(0.35±0.21)低于模型組(0.75±0.08)，P＜0.05