水通道蛋白5敲除對呼吸道粘液表達譜的影響及其信號轉(zhuǎn)導機制的研究.pdf

1、第一部分水通道蛋白5在慢性哮喘小鼠模型氣道炎癥和粘液分泌中的作用
　　目的：氣道粘液高分泌是慢性氣道疾病的特征，水通道蛋白5對于呼吸道液體分泌的量起著很重要的作用，本研究從動物水平探討在屋塵螨致敏的慢性哮喘小鼠模型中，水通道蛋白5基因敲除對氣道炎癥和粘液分泌的影響。
　　方法：應用水通道蛋白5基因敲除小鼠和野生型小鼠，屋塵螨滴鼻致敏制備慢性哮喘小鼠模型，HE檢測病理、炎癥評分，AB-PAS染色檢測小鼠氣道杯狀細胞的增生、免疫

2、組化和Rcaltime-PCR檢測小鼠氣道粘蛋白NUC5AC、NUC5B的表達及定量，ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和MUC5AC的表達。
　　結(jié)果：屋塵螨慢性滴鼻致敏后，和野生型小鼠相比，水通道蛋白5基因敲除鼠病理評分減輕，BALF中Th2細胞因子減少，Th1細胞因子增加，BALF液中MUC5AC蛋白、肺組織中MUC5AC、MUC5B基因和蛋白表達減少。
　　結(jié)

3、論：水通道蛋白5基因敲除慢性哮喘小鼠過敏性炎癥和氣道粘液分泌較野生型小鼠減輕。
　　第二部分水通道蛋白5對PMA誘導的原代小鼠氣道上皮細胞MUC5AC合成的影響
　　目的：氣道上皮是呼吸道和外環(huán)境相互作用的非特異性屏障，原代培養(yǎng)的氣道上皮細胞保留在體上皮細胞的特征和功能，是研究呼吸道上皮細胞很好的模型。本研究從細胞水平，探討AQP5對PMA誘導的原代培養(yǎng)小鼠氣道上皮細胞MUC5AC合成的影響及可能機制。
　　方法：原代

4、培養(yǎng)兩種小鼠(水通道蛋白5基因敲除鼠和野生鼠)氣道上皮細胞，transwell建立氣液平面，2周后掃描電鏡及角蛋白免疫組化鑒定氣道上皮細胞。PKC特異性激動劑PMA刺激原代小鼠氣道上皮細胞及PKC通路特異性阻斷劑Calphostinc阻斷該通路，ELISA檢測兩組小鼠MUC5AC蛋白水平的變化，用western blotting檢測兩組小鼠氣道上皮細胞PMA刺激后PKC、p-PKC、p-p38、p38、ERK、P-ERK的表達差異。

5、r>　　結(jié)果：氣液平面培養(yǎng)后，掃描電鏡顯示培養(yǎng)的細胞上皮有微絨毛和纖毛覆蓋，細胞角蛋白14免疫組化染色為陽性。PMA20ng/ml刺激24小時后，兩組小鼠氣道上皮細胞分泌的MUC5AC明顯升高，水通道蛋白5基因敲除鼠增加更顯著，兩者有顯著性差異。PKC特異性阻斷劑Calphostinc能阻斷PMA引起的兩組小鼠MUC5AC分泌。原代小鼠氣道上皮細胞經(jīng)PMA刺激后，western blotting檢測顯示PKC、p38磷酸化激活，ERK通

6、路無變化。
　　結(jié)論：AQP5通過Ca2+-PKC-p38信號通路影響粘蛋白MUC5AC的合成和分泌。
　　第三部分 LPS誘導的粘液下腺細胞MUC5AC和AQP5的變化和調(diào)控機制
　　目的：氣道粘液分泌物由水和粘蛋白MUC5AC等組成，水/粘蛋白的比例失調(diào)導致痰液粘稠，影響纖毛清除功能。本研究從細胞水平探討在LPS刺激粘液下腺SPC-A1細胞后，MUC5AC和AQP5的變化和調(diào)控機制。
　　方法：用LPS刺激S

7、PC-A1細胞，Realtime-PCR檢測AQP5和MUC5AC mRNA水平的變化，western blotting、ELISA法檢測AQP5和MUC5AC蛋白的變化。用EGFR抑制劑AG1478及MAPKs抑制劑(ERK抑制劑PD98059、p38 MAPK抑制劑ML3404、JNK抑制劑SP600125)干預，LPS刺激SPC-A1細胞6小時后Realtime-PCR檢測AQP5和MUC5ACmRNA的表達。
　　結(jié)果：L

8、PS刺激SPC-A1細胞后，MUC5AC基因和蛋白水平呈時間、濃度依賴性升高，同時AQP5基因和蛋白水平呈時間、濃度依賴性降低，兩者呈負相關。EGFR抑制劑、p38/JNK抑制劑顯著降低LPS誘導的MUC5ACmRNA的升高，p38/JNK抑制劑減輕AQPSmRNA的降低。
　　結(jié)論：P38/JNK抑制劑為AQP5和MUC5AC共同的信號通路，應用P38/JNK抑制劑能同時減輕LPS誘導MUC5AC和AQP5的變化，改善水/粘液比