miR--155在樹突狀細(xì)胞抗白念珠菌固有免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、白念珠菌（Candida albicans，C.albicans）作為一類條件致病菌，主要寄居在人體的皮膚和粘膜（如口腔、消化道和陰道）表面。在機(jī)體免疫功能正常時(shí)，白念珠菌與免疫系統(tǒng)維持相對(duì)穩(wěn)態(tài)，不會(huì)引發(fā)感染;而當(dāng)機(jī)體的免疫功能受到抑制時(shí)，白念珠菌與機(jī)體共存的穩(wěn)態(tài)被打破，白念珠菌迅速繁殖，由共生菌轉(zhuǎn)為致病菌。白念珠菌感染作為最常見的真菌感染，可有不同的臨床表現(xiàn)，輕者常引發(fā)局部粘膜損傷，重者可穿透組織、侵入外周血液循環(huán)，表現(xiàn)為播散性念珠菌

2、病，嚴(yán)重威脅患者生命。近些年來，由于抗生素濫用的現(xiàn)象仍未得到有效解決，且腫瘤放化療患者以及HIV感染病人的日益增多，導(dǎo)致白念珠菌感染的發(fā)病率不斷增高，而且播散性感染的病死率居高不下，這些至今仍是難以解決的臨床問題。因此，研究白念珠菌的致病機(jī)制、特別是深入研究機(jī)體免疫系統(tǒng)抗白念珠菌感染的調(diào)控過程，可為其相關(guān)的感染性疾病的治療提供幫助。
　　機(jī)體抵抗白念珠菌感染的第一道防線是由樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、中性

3、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等組成的固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以在第一時(shí)間通過非特異殺傷的方式清除致病菌，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)而且不具備免疫記憶功能。DCs作為專職的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)，其表面表達(dá)較高水平的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)。這些PRRs的主要生物學(xué)功能在于可以識(shí)別病原體表面的保守結(jié)構(gòu)，即病原體相關(guān)分子模式(pathogen-asso

4、ciated molecular patterns，PAMPs)，并由此開啟針對(duì)病原體感染的免疫應(yīng)答。白念珠菌細(xì)胞壁的PAMPs一旦被DCs表面的PRRs識(shí)別，可迅速活化DCs，分泌多種炎癥因子和趨化因子，促進(jìn)對(duì)白念珠菌的非特異性免疫清除。DCs的活化機(jī)制十分復(fù)雜，其核心事件是NF-κB、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（nuclear transcription factor activation protein-1，AP-1）等轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)

5、位，最終調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。另一方面，DCs還可以通過PRRs吞噬病原體，并將病原體抗原加工、遞呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，指導(dǎo)后續(xù)的特異性免疫應(yīng)答的類型和持續(xù)時(shí)間。固有免疫是獲得性免疫的起點(diǎn)和驅(qū)動(dòng)，而獲得性免疫可在固有免疫的基礎(chǔ)上發(fā)揮更持久且具有記憶功能的免疫效應(yīng)。值得注意的是，機(jī)體抗白念珠菌的免疫應(yīng)答過程需要多種機(jī)制的精細(xì)調(diào)控，若免疫反應(yīng)強(qiáng)度過弱，則無法有效清除病原體;但若免疫應(yīng)答強(qiáng)度過高或持續(xù)時(shí)間太長(zhǎng)，則容易導(dǎo)致機(jī)體

6、組織的炎癥性損傷。
　　microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約20個(gè)堿基左右的單鏈非編碼RNA，可以與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)(3'UTR)的堿基不完全互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生降解，或者直接抑制mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)作用。miRNAs的作用特點(diǎn)是一個(gè)miRNA可以同時(shí)在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，而一個(gè)基因的表達(dá)強(qiáng)度也可以受到多個(gè)miRNAs的調(diào)節(jié)，miRNAs對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)具有明顯的時(shí)

7、空特異性。近些年來，越來越多的研究表明，miRNAs在免疫細(xì)胞的發(fā)育和免疫應(yīng)答的進(jìn)程中發(fā)揮不可忽視的調(diào)控作用。在前期的研究中，我們采用microRNA芯片分析了白念珠菌刺激單核源DCs內(nèi)miRNAs的表達(dá)譜變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種miRNAs異常表達(dá)，其中miR-155表達(dá)顯著上調(diào)。再者，以往的研究表明miR-155在抗細(xì)菌、病毒的免疫反應(yīng)中具有活躍的調(diào)節(jié)功能，但目前miR-155在真菌感染免疫中的生物學(xué)功能尚不明確?；谝陨涎芯勘尘埃菊n題

8、探討了miR-155在樹突狀細(xì)胞抗白念珠菌感染的固有免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。
　　第一部分 熱滅活的白念珠菌對(duì)樹突狀細(xì)胞及CD4+Th細(xì)胞的活化作用及功能影響
　　目的:研究白念珠菌感染對(duì)樹突狀細(xì)胞的成熟及其功能的影響，進(jìn)而對(duì)CD4+Th細(xì)胞的活化和分化的影響。
　　方法:采用磁珠分選的方法從人外周血中分離CD14+單核細(xì)胞和CD4+Th細(xì)胞，加入GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞分化為未成熟的DC

9、s。用熱滅活的白念珠菌刺激DCs，檢測(cè)DCs的成熟表面標(biāo)志物的表達(dá)及炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌。然后將負(fù)載了白念珠菌的DCs與CD4+Th細(xì)胞共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th細(xì)胞的活化及IFN-γ、IL-17等細(xì)胞因子的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:熱滅活的白念珠菌可以顯著上調(diào)DCs表面的成熟標(biāo)志物CD83、CD86的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的釋放

10、。負(fù)載白念珠菌的DCs與CD4+Th細(xì)胞共培養(yǎng)后，T細(xì)胞表面的活化標(biāo)志物CD69表達(dá)上調(diào)，胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17的分泌水平明顯升高。
　　結(jié)論:熱滅活的白念珠菌可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，并誘導(dǎo)CD4+Th細(xì)胞活化分化，發(fā)揮有效的抗真菌效應(yīng)。
　　第二部分 熱滅活的白念珠菌可以上調(diào)樹突狀細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)
　　目的:研究熱滅活白念珠菌能否促進(jìn)miR-155的表達(dá)和分泌。
　　方法:用熱滅活的白念珠

11、菌刺激DCs，qRT-PCR檢測(cè)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)。收集白念珠菌刺激DCs后的培養(yǎng)上清液，并提取外泌體，檢測(cè)上清液和外泌體中miR-155的表達(dá)。通過qRT-PCR檢測(cè)白念珠菌刺激DCs后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子的變化情況，以及在DCs、單核細(xì)胞、THP-1細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中miR-155的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:熱滅活的白念珠菌可以顯著上調(diào)DCs內(nèi)miR-155的表達(dá)，并且白念珠菌刺激DCs的培養(yǎng)上清及外泌體中miR-1

12、55表達(dá)也明顯上調(diào)。白念珠菌誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，而miR-155的表達(dá)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，后期與炎癥因子的表達(dá)趨勢(shì)相反。此外，在單核細(xì)胞、THP-1和RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，白念珠菌同樣可以持續(xù)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)。
　　結(jié)論:熱滅活的白念珠菌可以持續(xù)上調(diào)miR-155的表達(dá)，且miR-155可以通過外泌體分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中。同時(shí)白念珠菌刺激下炎癥因子的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在炎癥后期與miR-15

13、5的表達(dá)趨勢(shì)相反。
　　第三部分 miR-155對(duì)DCs分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究
　　目的:探究miR-155對(duì)白念珠菌誘導(dǎo)的DCs分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)作用以及分子機(jī)制。
　　方法:將miR-155的模擬體和抑制體轉(zhuǎn)染DCs，然后加入熱滅活的白念珠菌，分別采用qRT-PCR和ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的變化。采用生物信息學(xué)軟件TargetS can、miRDB和microR

14、NA.org預(yù)測(cè)miR-155的靶基因，并通過western blotting和熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)miR-155對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用，最后轉(zhuǎn)染siRNA干擾靶基因的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)下游炎癥因子分泌的影響。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)入miR-155的模擬體后，白念珠菌誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌明顯降低;而轉(zhuǎn)入miR-155的抑制體后，炎癥因子的變化趨勢(shì)與之相反。在白念珠菌刺激的DCs中，miR-155可以

15、與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65和上游BCL10的3'UTR端靶向結(jié)合抑制其表達(dá)。此外，干擾BCL10可明顯抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減弱白念珠菌上調(diào)炎癥因子的表達(dá)能力。
　　結(jié)論:在白念珠菌感染中，持續(xù)表達(dá)上調(diào)的miR-155對(duì)炎癥因子的分泌具有明顯的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制可能與靶向抑制BCL10及NF-κBp65的表達(dá)，進(jìn)一步影響NF-κB通路的激活有關(guān)。
　　第四部分 白念珠菌活化的DCs內(nèi)miR-155表達(dá)上調(diào)的機(jī)

16、制研究
　　目的:探究熱滅活白念珠菌上調(diào)miR-155表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:加入Dectin-1的激動(dòng)劑，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá)變化。在白念珠菌刺激DCs前加入Dectin-1的抑制劑或siRNA預(yù)處理，然后檢測(cè)miR-155的表達(dá)變化。分別采用細(xì)胞免疫熒光、Western blotting檢測(cè)熱滅活白念珠菌刺激DCs后轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位情況以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化表達(dá)。

17、在白念珠菌刺激的DCs之前預(yù)先加入NF-κB或MAPK信號(hào)通路的特異性抑制劑，研究這兩條通路對(duì)白念珠菌上調(diào)miR-155表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:加入Dectin-1的激動(dòng)劑可以明顯上調(diào)miR-155的表達(dá)，而加入Dectin-1受體的特異性阻斷劑或siRNA均會(huì)抑制白念珠菌上調(diào)miR-155表達(dá)的能力。熱滅活的白念珠菌可以促進(jìn)NF-κB p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，并激活MAPK的ERK、JNK通路及下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的磷酸化;進(jìn)