鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在白念珠菌形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答中的功能研究.pdf

1、白念珠菌是臨床常見的條件性致病真菌之一。由于重癥特護人群、免疫缺陷人群的增加及抗生素的濫用，白念珠菌感染，尤其是白念珠菌侵襲性感染備受人們關(guān)注。白念珠菌是一種典型的兩型性真菌，具有菌絲發(fā)育、生物被膜形成等形態(tài)發(fā)生能力，這些能力與該真菌的形態(tài)發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及分泌途徑具有密切聯(lián)系。不僅如此，白念珠菌還具有極為精細的環(huán)境壓力應(yīng)答系統(tǒng)，用以感應(yīng)抗真菌藥物、氧化脅迫、營養(yǎng)匱乏等諸多環(huán)境壓力，并對其作用應(yīng)答，使自身得以存活與生長。白念珠菌的形態(tài)發(fā)生與

2、壓力應(yīng)答能力均是白念珠菌在宿主體內(nèi)進行有效定殖并造成感染所必需的，而這些能力又與白念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的功能緊密相關(guān)。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與液泡是白念珠菌細胞兩種極為重要的細胞器。前者是細胞分泌途徑的核心，同時也是介導壓力應(yīng)答的主要細胞器。后者是白念珠菌細胞最主要的鈣庫，在調(diào)控細胞鈣穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要角色。盡管白念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中的許多成員已為人們所知，但維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能所必需的鈣泵尚未得到鑒定，且液泡鈣通道Yvc1的功能仍屬未知。此外，盡管人

3、們已明確白念珠菌鈣通道在形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答過程中發(fā)揮重要功能，但目前尚無有效抑制鈣通道活性，進而指導臨床實踐的報道。本研究針對以上三個重要問題，對白念珠菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵進行鑒定及功能分析，并對液泡鈣通道Yvc1的功能進行探索，同時研究鈣通道阻斷劑對白念珠菌形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答的影響，以期發(fā)現(xiàn)白念珠菌的新型毒力相關(guān)因子，并為臨床治療白念珠菌感染提供新的參考。本研究的主要結(jié)果如下:
　　(1)通過BLASTP分析，從白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒

4、定出一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵Spf1。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于V型P-ATPase家族成員。采用鎳柱純化技術(shù)，純化得到Spf1蛋白，酶活分析發(fā)現(xiàn)該蛋白具有ATPase活性。通過對SPF1缺失菌株spf1△/△的研究發(fā)現(xiàn)，spf1△/△在正常生長條件下的生長速率明顯降低，菌絲發(fā)育能力明顯減弱，生物被膜形成、絮凝、粘附等能力顯著下降，對抗真菌藥物、低鈣、高鈣、氧化脅迫、堿性pH及膜損傷等諸多環(huán)境壓力高度敏感，并且喪失了系統(tǒng)性感染小鼠的能力。上述結(jié)

5、果表明，Spf1作為白念珠菌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵，在白念珠菌正常生長、形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用，是白念珠菌一種重要的毒力相關(guān)因子。
　　(2)采用fluo-3熒光探針法及原子吸收分光光度法，分析SPF1缺失對白念珠菌胞質(zhì)鈣及總鈣含量的影響，發(fā)現(xiàn)其缺失導致壓力條件下白念珠菌細胞鈣穩(wěn)態(tài)的嚴重紊亂，證明Spf1在維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要角色。通過Westernblotting及內(nèi)切糖苷酶(EndoH)分析，發(fā)現(xiàn)SPF1缺失導致N

6、-糖基化蛋白Cdc101及分泌型酸性磷酸酶(SAP)糖基化的缺陷，表明Spf1在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，尤其是其糖基化功能方面發(fā)揮作用。通過細胞壁壓力敏感性測定，細胞壁重構(gòu)及組分分析，發(fā)現(xiàn)SPF1缺失導致白念珠菌對細胞壁壓力的敏感性增強，細胞壁重構(gòu)能力降低以及細胞壁組成異常，揭示了Spf1在細胞壁完整性(CWI)維持方面的重要功能。β-半乳糖苷酶分析及RT-PCR結(jié)果表明，SPF1缺失影響白念珠菌諸多基因的表達，主要表現(xiàn)在鈣應(yīng)答基因CCH1，C

7、WI基因PGA13、ECM331、DFG5及氧化應(yīng)答基因OYE32的表達顯著上調(diào)，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能必需基因SEC61，形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因HWP1、ALS3及ECE1的表達顯著下調(diào)。上述結(jié)果揭示了白念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)答系統(tǒng)與形態(tài)發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間存在緊密聯(lián)系。
　　(3)液體培養(yǎng)及點板實驗表明，yvc1△/△菌株表現(xiàn)為對低鈣、高鈣、堿性pH、氧化脅迫等諸多環(huán)境壓力的敏感性增強;通過流式細胞技術(shù)，發(fā)現(xiàn)堿性刺激下yvc1△/△喪失了

8、第二次鈣波動的能力，而在高滲刺激下完全喪失鈣波動的能力;在氧化脅迫條件下，yvc1△/△菌株的ROS水平顯著偏高，抗氧化酶SOD與CAT的活性及氧化應(yīng)答基因表達量均顯著偏低。在形態(tài)發(fā)生方面，yvc1△/△菌株的菌絲發(fā)育、絮凝、侵染式生長、生物被膜形成等諸多形態(tài)發(fā)生能力均明顯下降，形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因的表達量顯著下調(diào)。首次采用FM4-64及fluo-3對白念珠菌菌絲頂端液泡、頂體及胞質(zhì)鈣進行共染色，發(fā)現(xiàn)yvc1△/△菌絲頂端不存在液泡、頂體以

9、及高鈣梯度，表明Yvc1所介導的液泡鈣釋放在白念珠菌形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用，而且這種作用與形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因的表達以及極性生長有關(guān)。系統(tǒng)性感染及上皮細胞侵染實驗表明，yvc1△/△菌株系統(tǒng)性感染小鼠的能力，以及侵染、損傷宿主上皮細胞及菌絲重新定向能力均顯著下降。上述結(jié)果表明，Yvc1介導的液泡鈣釋放在白念珠菌壓力應(yīng)答及形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　　(4)采用酶標儀對fluo-3熒光信號進行動力學掃描，發(fā)現(xiàn)鈣通道阻斷劑維拉帕米（v

10、erapamil）能夠明顯抑制堿性刺激及藥物刺激下白念珠菌的鈣波動，而硝苯地平(nifedipine)同樣明顯抑制堿性刺激引起的鈣波動，但對藥物刺激下的鈣內(nèi)流不具有抑制作用。采用棋盤法(Chequerboard test)測定鈣通道阻斷劑與抗真菌藥物對白念珠菌生長的協(xié)同抑制作用，發(fā)現(xiàn)verapamil與抗真菌藥物氟康唑(fluconazole)、衣霉素（tunicamycin）具有協(xié)同作用，說明verapamil能夠降低白念珠菌耐受抗真