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1、鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)是一個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的多功能蛋白,全長(zhǎng)CRT具有416個(gè)氨基酸序列,約46kDa,N端有一個(gè)17個(gè)氨基酸的信號(hào)序列,C端有KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列。CRT具有N,P和C三個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中P和C結(jié)構(gòu)域具有超強(qiáng)的結(jié)合Ca2+能力,維持胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài),參與Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路。此外,CRT在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中行使其分子伴侶的功能,通過N-domain的凝集素結(jié)合序列保證新合成蛋白的正確折疊。越來越多的證
2、據(jù)表明CRT在細(xì)胞膜上也發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,包括介導(dǎo)細(xì)胞粘附,參與凋亡細(xì)胞清除等。此外,病理狀況下體液中可溶性CRT的存在也屢見報(bào)道,包括自身免疫病、腫瘤等。
臨床以及實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)都提示CRT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,主要體現(xiàn)在:1)CRT在腫瘤組織中高表達(dá)或在體液中出現(xiàn)對(duì)于腫瘤具有一定的輔助診斷價(jià)值;2)高表達(dá)CRT的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng);3)可溶性CRT抑制腫瘤血管新生;4)膜型CRT介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡(immu
3、nogenic death)。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作顯示,原核表達(dá)CRT片段39-272(rCRT/39-272)具有較強(qiáng)的免疫刺激活性及佐劑效應(yīng)。本課題的主要內(nèi)容是圍繞CRT與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,結(jié)合其對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用,利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞株考察可溶性CRT對(duì)細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的影響并探索其機(jī)制。
我們構(gòu)建了eCRT/39-272的真核表達(dá)載體,并獲得了持續(xù)分泌 eCRT/39-272的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,從培養(yǎng)上清中用鎳柱純
4、化得到真核重組表達(dá)的eCRT/39-272。體外實(shí)驗(yàn)表明,eCRT/39-272可刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMC)分泌炎性因子 TNF-α、IL-6,NO,且其發(fā)揮功能依賴于TLR4所介導(dǎo)的信號(hào)通路。
對(duì)持續(xù)分泌eCRT/39-272的CHO細(xì)胞株及其對(duì)照細(xì)胞株體外成瘤指標(biāo)考察發(fā)現(xiàn)分泌eCRT/39-272不影響CHO細(xì)胞體外的增殖速度、克隆形成能力,但增強(qiáng)了CHO細(xì)胞的粘附和遷移能力。與裸鼠皮下接種CHO-eCRT/39-27
5、2及其對(duì)照細(xì)胞CHO-EGFP,CHO-eCRT/39-272成瘤率顯著高于CHO-EGFP,且腫瘤體積比CHO-EGFP大約二倍。進(jìn)一步的研究表明裸鼠左右兩側(cè)皮下同時(shí)接種CHO-eCRT/39-272和CHO-EGFP,血清中存在的eCRT/39-272并不促進(jìn)CHO-EGFP腫瘤的生長(zhǎng)。分析荷瘤小鼠外周血以及脾臟中的B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、骨髓來源的抑制細(xì)胞(MDSC)、自然殺傷細(xì)胞比例,發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯差異。對(duì)腫瘤組織局部浸潤(rùn)的
6、免疫細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),腫瘤組織局部的MDSC細(xì)胞比例顯著增加,提示其可能參與了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)腫瘤組織局部進(jìn)行細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)與MDSC遷移相關(guān)的趨化因子CCL5上調(diào),并且非免疫系統(tǒng)依賴的效應(yīng)分子金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2表達(dá)增加。
綜上所述,與前期描述的CRT作為血管抑素抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用不同,持續(xù)分泌表達(dá)eCRT/39-272的CHO細(xì)胞體內(nèi)成瘤性顯著增強(qiáng),這種促腫瘤的作用可能與腫瘤局部高濃度eCRT/39-27
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