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文檔簡介
1、目的:探討小鼠肺成纖維細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡時Ⅰ型膠原蛋白的表達以及肺成纖維細胞凋亡情況,本研究使用鈣離子拮抗劑-粉防己堿(Tetrandrine,Tet)和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑-毒胡蘿卜素(Thapsigargin,TG)體外作用小鼠肺成纖維細胞,觀察鈣離子(Ca2+)失衡時,內質網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)指標和細胞凋亡情況,從ERS途徑探討細胞凋亡信號通路,闡明Ca2+、ERS、細胞凋亡的作用機
2、理,為臨床上防治肺纖維化疾病提供理論依據(jù)。
方法:液氮凍存的小鼠肺成纖維細胞,放入37℃恒溫水浴箱內進行融化,快速接種于剛配置好的完全培養(yǎng)基內,放置于5%CO2、37℃恒溫孵育箱內,定期通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶內細胞生長情況,經(jīng)常規(guī)的換液、傳代培養(yǎng)和同步化。根據(jù)MTT檢測結果將細胞分為4組,即對照組、轉化生長因子-β1(TGF-β1)組、鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組。對照組細胞給予完全培養(yǎng)基,其他3組給予5ng/ml
3、 TGF-β1作用24h后,鈣離子拮抗劑組和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組再分別給予5mg/l Tet和4μM TG作用細胞24h。進行掃描電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)、流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率和細胞周期比例、激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞內Ca2+水平、Western-blot方法檢測Ⅰ型膠原、GRP78、Calpain-2、CHOP,免疫組織細胞化學方法檢測caspase-12、caspase-3蛋白表達。
結果:1細胞形態(tài)對照組和TGF
4、-β1組在掃描電子顯微鏡下觀察,細胞膜、細胞核、染色質形態(tài)完整,加入鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑的兩組細胞均出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài):細胞漿濃縮、細胞體積縮小、染色質逐漸聚集呈月牙形等。2細胞周期各組間,G1期、S期、G2期變化均有顯著性差異(P<0.05);與對照組相比較,加入TGF-β1作用后的細胞的G1期細胞比例降低(P<0.05),S期細胞比例明顯增加(P<0.05),G2期細胞比例下降(P<0.05);與TGF-β1組相比較,加
5、入鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑作用后的細胞,G2期和S期細胞比例均明顯減少(P<0.05),G1期比例均明顯增加(P<0.05);3細胞凋亡流式細胞儀檢測結果發(fā)現(xiàn),對照組、TGF-β1組、鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組的凋亡率分別為6.73%、5.03%、9.60%、21.53%,各組間比較差異顯著(P<0.05);鈣離子拮抗劑組和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組凋亡率明顯高于對照組和TGF-β1組。4 Ca2+濃度各組間比較差異顯著(P<0.
6、05);與對照組相比較,TGF-β1組細胞內熒光度值變化不明顯(P>0.05);與TGF-β1組相比較,加入鈣離子拮抗劑后,細胞內的熒光度值明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但加入肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑后,細胞內熒光度值明顯升高(P<0.05);5 Western-blot檢測結果各組間成纖維細胞內Ⅰ型膠原蛋白、GRP78、CHOP和Calpain-2蛋白的表達均有顯著性差異(P<0.05);TGF-β1組的Ⅰ型膠原蛋白表達明顯高
7、于對照組(P<0.05),但鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組的Ⅰ型膠原蛋白表達顯著降低對照組和TGF-β1組(P<0.05)。與對照組相比,TGF-β1組的GRP78和CHOP蛋白表達差異不明顯(P>0.05),而鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組GRP78和CHOP蛋白表達明顯高于對照組和TGF-β1組(P<0.05)。與對照組相比,TGF-β1組和鈣離子拮抗劑組的Calpain-2蛋白表達差異不明顯(P>0.05),肌漿網(wǎng)
8、鈣泵抑制劑組Calpain-2蛋白表達明顯升高(P<0.05),而鈣離子拮抗劑組的Calpain-2蛋白表達與TGF-β1組比較差異不明顯(P>0.05),肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組Calpain-2蛋白表達明顯升高(P<0.05);6免疫細胞組織化學檢測結果各組間成纖維細胞內caspase-12、caspase-3蛋白表達均有顯著性差異(P<0.05);與對照組相比,TGF-β1組的caspase-12、caspase-3蛋白表達差異不明顯(
9、P>0.05),鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組caspase-12、caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.05),與TGF-β1組比較,鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組caspase-12、caspase-3蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。
結論:1鈣離子拮抗劑和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑能改變成纖維細胞周期分布,促進成纖維細胞凋亡。2鈣離子拮抗劑和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑可使肺成纖維細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡,誘導ERS,
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