福辛普利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化TLR4表達(dá)的影響及125I標(biāo)記TLR4的體外研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)所導(dǎo)致的冠心病,是危害人類健康的三大疾病之一,并且已經(jīng)成為老年人的多發(fā)病和主要死亡因?yàn)?。如何診斷及治療AS,降低冠心病的發(fā)生率、致殘率及病死率,一直是世界各國(guó)學(xué)者積極探討的熱點(diǎn)課題之一。
　　 AS以血管壁內(nèi)脂質(zhì)、炎性細(xì)胞聚集為特征,普遍認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病,在其進(jìn)展的各個(gè)階段都可以觀察到炎癥細(xì)胞及炎癥因子的存在[1]。激活的炎癥細(xì)胞釋放大量的炎癥因子,導(dǎo)致血管壁內(nèi)皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而引起脂質(zhì)沉積和內(nèi)膜增生,

2、導(dǎo)致AS[2]。
　　 Toll樣受體-4(TLR4)是一種炎癥受體,主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞上[3-5]。目前多數(shù)研究認(rèn)為TLR4在AS的發(fā)生發(fā)展整個(gè)過(guò)程中具有重要作用[6-8],是聯(lián)系炎癥反應(yīng)和AS之間的橋梁[9],因此,深入研究TLR4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的價(jià)值,有望為AS診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。理論上講,針對(duì)TLR4的拮抗劑有可能應(yīng)用于AS的防冶[10]。
　　 目前國(guó)內(nèi)外的研究顯示他汀類

3、[11-13]及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類[14-16]藥物可在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中抑制TLR4的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抗炎抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。那么,ARB受體的抗炎作用是否可以推進(jìn)到血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類藥物呢?已有研究顯示,ACEI類藥物-福辛普利除具有降壓及保護(hù)心肌作用之外,還有抗AS的作用。那么,其抗炎機(jī)制如何?是否通過(guò)影響TLR4表達(dá),抑制炎癥反應(yīng),進(jìn)而發(fā)生抗炎效應(yīng)呢?因此本研究前兩部分將從活體和細(xì)胞水平探討了福辛普利及

4、其活性產(chǎn)物福辛普利拉對(duì)AS、TLR4及下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)的影響,從而探討其抗AS作用的機(jī)制。
　　 分子顯像是診斷AS的新亮點(diǎn)[17,18],可以從生理生化水平識(shí)別AS[19]。即針對(duì)AS內(nèi)的分子事件(如細(xì)胞表達(dá)的炎癥受體)設(shè)計(jì)合成不同的分子探針,再利用不同的影像技術(shù)對(duì)這些分子探針進(jìn)行成像,對(duì)AS早期分子水平改變進(jìn)行分析和診斷[20-22]。鑒于TLR4在AS中的重要作用以及在斑塊內(nèi)大量表達(dá),如果能制備TLR4的分子探針

5、,使之有效檢測(cè)AS,將為研究TLR4和AS提供有力的幫助。目前還沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道,因此本研究第三部分將初步探索TLR4分子探針的制備條件及可行性,為未來(lái)在體分子顯像研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分福辛普利對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化血管TLR4表達(dá)的影響
　　 目的:探討福辛普利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔模型斑塊面積及TLR4、NF-κB表達(dá)的影響。
　　 方法：將18只體重為2-2.5公斤的新西蘭大白兔隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組(n=6

6、,喂食普通飼料100g/d)、高脂飲食組(n=6,喂食高脂飼料100g/d)和福辛普利組(n=6,喂食高脂飼料100g/d+福辛普利5mg/d)。喂養(yǎng)24周,證實(shí)建模成功后處死,病理方法測(cè)量主動(dòng)脈內(nèi)膜及斑塊面積；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)及免疫印跡分析(Western blotting)方法檢測(cè)TLR4 mRNA和蛋白水平的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與

7、正常對(duì)照組相比,高膽固醇飲食組及福辛普利治療組主動(dòng)脈均有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。但福辛普利治療組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積占血管內(nèi)膜面積的比例(0.3847±0.0615)較高膽固醇飲食組(0.5757±0.0374)明顯降低(P<0.01)。高膽固醇飲食組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR4蛋白、mRNA及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平分別為0.4700±0.0560、2.8150±0.5307、0.3787±0.1845,而福辛普利治療組為0.3612

8、±0.0360、1.9225±0.5789、0.2555±0.0905。與高膽固醇飲食組相比,福辛普利組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01),細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的活性降低(P<0.01)。
　　 結(jié)論：福辛普利可以減少主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化面積、降低TLR4和NF-κB的表達(dá),具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。
　　 第二部分福辛普利拉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人白血病單核細(xì)胞系細(xì)胞TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　

9、 目的:研究福辛普利拉(Fos)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人白血病單核細(xì)胞系細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分8組:對(duì)照組(正常THP1細(xì)胞)、脂多糖(Iipopolysaccharide,LPS)刺激組(THP1細(xì)胞+LPS)、DMSO組(THP1細(xì)胞+LPS+DMSO)、Fos10μmol/L干預(yù)組、Fos5μmol/L干預(yù)組、Fos1μmol/L干預(yù)組、Fos0.5μmol/L干預(yù)組、Fos

10、0.25μmol/L干預(yù)組。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測(cè)人白血病單核細(xì)胞系(THP1)細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞儀和Western blotting檢測(cè)TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-1β and TNF-α的分泌水平。
　　 結(jié)果：10、5、1、0.5、0.25μmol/L的Fos可顯著降低LPS誘導(dǎo)的THP1細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋

11、白的表達(dá)(P<0.05),抑制NF-κB的活性(P<0.05),其中1、0.5μmol/L的Fos作用最明顯。
　　 結(jié)論：Fos能下調(diào)LPS誘導(dǎo)的THP1細(xì)胞中TLR4的表達(dá),并可以抑制NF-κB的活性
　　 第三部分125I-anti-TLR4的制備方法及其與THP1細(xì)胞結(jié)合特性初步研究
　　 目的:建立放射性核素125I標(biāo)記抗TLR4抗體的制備方法,以及探索其與THP1細(xì)胞體外受體結(jié)合特性。
　　

12、方法：采用Iodogen固相氧化方法進(jìn)行放射性碘化得到125I標(biāo)記的抗TLR4抗體。反應(yīng)液用葡聚糖凝膠Sephadex G25-80柱層析法分離純化。反應(yīng)的標(biāo)記率、標(biāo)記物放射化學(xué)純度和穩(wěn)定性用硅膠紙層析測(cè)定,其蛋白含量用蛋白分析藥盒。125I標(biāo)記的抗TLR4抗體的生物活性用飽和競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合法分析,其中受體的靶載體是THP1細(xì)胞。
　　 結(jié)果：125I標(biāo)記抗TLR4抗體的最佳條件是:10μg Iodogen固相氧化劑,5μg抗TL

13、R4抗體和500uCi(18.5 MBq)Na125I,室溫反應(yīng)10分鐘,標(biāo)記率可達(dá)到85％。標(biāo)記物(125I標(biāo)記抗TLR4抗體)的比活度是0.56TBq/mmol,放射化學(xué)純度都大于95％,并且穩(wěn)定性是好的,在PBS緩沖液中-20℃放存4個(gè)星期,游離125I-不大于2％。125I標(biāo)記的抗TLR4抗體與THP1細(xì)胞的最大特異結(jié)合率在30％～80％之間,進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)抗體的標(biāo)記物的生物活性沒(méi)有很大的差別,這些結(jié)合具有可逆性、特異性和飽和性。<