TLR4誘導(dǎo)自噬與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系以及干預(yù)治療的研究.pdf

1、腦血管病是威脅人類生命的主要疾病之一。目前很多研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的破裂和栓子的脫落是引起急性心血管事件及腦卒中的重要原因，頸動(dòng)脈斑塊造成的血管狹窄甚至閉塞、斑塊的突然破裂導(dǎo)致急性的動(dòng)脈阻塞都可以引起缺血性腦卒中。因此，頸動(dòng)脈斑塊的早期識(shí)別、斑塊穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)以及干預(yù)阻止其進(jìn)展對(duì)于心腦血管病的防治意義重大。
　　第一部分 TLR4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和進(jìn)展中的作用機(jī)制
　　目的：觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（AP）形成和發(fā)展

2、中Toll樣受體4（TLR4）表達(dá)的變化，探討TLR4在AP形成和發(fā)展的過程中的作用機(jī)制。
　　材料與方法：8周齡ApoE(-/-)小鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組5只，包括對(duì)照組、普通飲食組、10周模型組和20周模型組。對(duì)照組處死，普通飲食組給予普通飼料喂養(yǎng)10周后處死，10周模型組和20周模型組分別予高脂飲食喂養(yǎng)10周和20周后處死，取血檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、氧化型低密度脂蛋白（oxLDL

3、），留取頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈標(biāo)本，觀察斑塊情況，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行 HE染色、油紅 O染色、彈力纖維染色以及天狼猩紅染色。并通過免疫組化檢測(cè)頸動(dòng)脈斑塊巨噬細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)蛋白水平、TLR4、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.普通飼料組TC、TG、oxLDL水平較對(duì)照組升高（P<0.05）；10周模型組較普通飼料組血脂明顯升高（P<0

4、.05），AP形成。
　　2.20周模型組較對(duì)照組和10周模型組血清 TC、TG、oxLDL水平升高（P<0.05），AP明顯增多，斑塊脂質(zhì)成分增加，彈力纖維中斷、減少，膠原成分減少，巨噬細(xì)胞增加，平滑肌細(xì)胞減少。
　　3.20周模型組較對(duì)照組和10周模型組頸動(dòng)脈斑塊 TLR4、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. ApoE(-/-)小鼠高脂飲食可以成功建立AP動(dòng)脈的動(dòng)

5、物模型，且高脂飲食的時(shí)間越長，AP越明顯。
　　2. ApoE(-/-)小鼠通過高脂飲食建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型后oxLDL水平增高，動(dòng)脈及斑塊炎癥因子水平增高，巨噬細(xì)胞增多，血管平滑肌細(xì)胞減少，膠原合成減少，從而促進(jìn)斑塊的進(jìn)展，并降低斑塊的穩(wěn)定性。
　　3. ApoE(-/-)小鼠隨著動(dòng)脈粥樣硬化的加劇，TLR4和炎性因子的表達(dá)增加，可能參與促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展。
　　第二部分TLR4誘導(dǎo)自噬與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)

6、定性的關(guān)系
　　目的：觀察 ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊 TLR4表達(dá)與自噬的關(guān)系，探討TLR4誘導(dǎo)自噬對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（AP）穩(wěn)定性的影響。
　　方法：8周齡 ApoE(-/-)小鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予高脂飲食10周后隨機(jī)分為3組，每組8只，包括LPS組、對(duì)照組、TAK組。LPS組給予LPS（1mg/kg）腹腔注射，每周2次；TAK組給予TAK-242（0.3mg/kg）腹腔注射，每周2次；對(duì)照組給予

7、相應(yīng)的等容積的生理鹽水腹腔注射，每周2次。三組仍繼續(xù)高脂飲食，腹腔注射10周后取血檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）。留取頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈標(biāo)本，觀察斑塊情況，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行 HE染色、油紅 O染色、彈力纖維染色以及天狼猩紅染色。并通過免疫組化檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)蛋白水平、Toll樣受體4（TLR4）、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)。Western

8、 Blot檢測(cè)LC3Ⅱ/Ⅰ， Beclin-1，P62水平。
　　結(jié)果：
　　1. LPS組小鼠血清TC、TG、oxLDL水平高于對(duì)照組和TAK組小鼠（P<0.05）；TAK組TG、oxLDL水平低于對(duì)照組（P<0.05）。
　　2. LPS組小鼠AP較對(duì)照組和TAK組巨噬細(xì)胞含量（MAMO-2免疫組化染色陽性率）增多（P<0.05），TAK組較對(duì)照組小鼠AP巨噬細(xì)胞含量減少（P<0.05）。LPS組較對(duì)照組和TAK小

9、鼠AP平滑肌細(xì)胞含量（α-actin免疫組化染色陽性率）減少（P<0.05）；TAK組較對(duì)照組平滑肌含量增加（P<0.05）。
　　3. LPS組小鼠AP與對(duì)照組和TAK組比較，TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)增加（P<0.05）；TAK組較對(duì)照組TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)減少（P<0.05）。
　　4.對(duì)照組、LPS組和TAK組小鼠動(dòng)脈LC3Ⅱ/Ⅰ、P62和Beclin-1蛋白表達(dá)量有

10、差異（P<0.05）。LPS組較對(duì)照組和TAK組LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)增加（P<0.001）。LPS組較對(duì)照組和TAK組Beclin-1表達(dá)增加（P<0.001)；TAK組較對(duì)照組Beclin-1表達(dá)減少(P<0.001)。LPS組較對(duì)照組和TAK組P62表達(dá)增加(P<0.001)；TAK組較對(duì)照組P62表達(dá)增加(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1. LPS可以上調(diào)AP TLR4的表達(dá)，TAK-242下調(diào)TLR4的表達(dá)。

11、　　2. LPS上調(diào)TLR4表達(dá)后，促進(jìn)炎癥因子的分泌，加重脂代謝紊亂，自噬水平明顯增高，但P62蛋白水平同時(shí)升高，可能LPS導(dǎo)致過度自噬而出現(xiàn)自噬功能異常，反而加劇了AP進(jìn)展和易損性增加。
　　3. TAK-242通過下調(diào)TLR4的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞，增加平滑肌細(xì)胞的含量，增加斑塊的穩(wěn)定性。
　　第三部分阿托伐他汀及聯(lián)合普羅布考對(duì)TLR4誘導(dǎo)自噬的影響
　　目的：評(píng)價(jià)阿托伐他汀及聯(lián)合普羅布考對(duì)TLR4誘導(dǎo)的自噬的影響

12、，探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。
　　方法：8周齡 ApoE(-/-)小鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予以高脂飲食10周，再隨機(jī)分為3組，每組8只，包括對(duì)照組、他汀組、聯(lián)合組。對(duì)照組給予等容積超純水灌胃10周，每天1次；他汀組，高脂飲食的同時(shí)給予阿托伐他?。?0mg/kg/d）灌胃10周，每天1次；③聯(lián)合組，換喂食普羅布考飼料，同時(shí)給予阿托伐他汀（10mg/kg/d）灌胃10周，每天1次。取血檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（T

13、G）、氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）。留取頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈標(biāo)本，觀察斑塊情況，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行 HE染色、油紅 O染色、彈力纖維染色和天狼猩紅染色。并通過免疫組化檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)蛋白水平、Toll樣受體4（TLR4）、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1，P62水平。
　　結(jié)果：
　　1.他汀組和聯(lián)合組 TC和 oxL

14、DL水平較對(duì)照組降低，聯(lián)合組較他汀組oxLDL水平降低（P<0.05）。
　　2.他汀組和聯(lián)合組與對(duì)照組比較，頸動(dòng)脈 AP彈力纖維較完整，脂質(zhì)含量減少，膠原含量增加，TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)減低、平滑肌細(xì)胞增加，易損指數(shù)降低（P<0.05）。聯(lián)合組較他汀組小鼠頸動(dòng)脈AP巨噬細(xì)胞含量減少，易損指數(shù)降低（P<0.05）。
　　3.對(duì)照組、他汀組和聯(lián)合組小鼠動(dòng)脈LC3Ⅱ/Ⅰ、P62和Beclin-1蛋白表達(dá)

15、量有差異（ P<0.05）。他汀組和聯(lián)合組與較對(duì)照組動(dòng)脈 Beclin-1表達(dá)增加（ P<0.05）；聯(lián)合組較對(duì)照組和他汀組 LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)增加， P62表達(dá)減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.阿托伐他汀可下調(diào)TLR4表達(dá)，降低血脂，抑制氧化應(yīng)激和炎癥因子的分泌，增加斑塊的穩(wěn)定性。
　　2.聯(lián)合應(yīng)用阿托伐他汀和普羅布考較單獨(dú)應(yīng)用阿托伐他汀具有更強(qiáng)的抑制氧化應(yīng)激的作用，減少巨噬細(xì)胞含量，適當(dāng)?shù)卦黾恿俗允伤?，發(fā)