TLR4在脊髓擠壓傷后的表達(dá)及作用.pdf

1、脊髓損傷(SpinalCordinjury，SCI)后神經(jīng)功能修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界極具挑戰(zhàn)性的難題。近年來(lái)由于建筑業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)的高速發(fā)展，SCI發(fā)病率逐年增高。脊髓損傷常導(dǎo)致不同程度的肢體殘障，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)極大痛苦及沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此研究脊髓損傷后的病理生理變化，進(jìn)而探索促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能修復(fù)的治療措施，減輕患者痛苦，提高其生活質(zhì)量，已成為急待解決的主要課題。隨著對(duì)脊髓損傷研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后包括兩階段病理變化

2、：一是原發(fā)性損傷，另一階段是由原發(fā)性損傷引起的繼發(fā)性損傷，而繼發(fā)性損傷的損傷范圍遠(yuǎn)大于原發(fā)性損傷，加劇了脊髓損傷的范圍和程度。因此研究脊髓繼發(fā)性損傷的病理機(jī)制，以及發(fā)現(xiàn)減輕繼發(fā)性損傷的治療手段已成為神經(jīng)科學(xué)研究工作者一直致力追求的目標(biāo)。
　　研究表明，繼發(fā)性損傷機(jī)理主要包括血管的破壞缺血、炎癥反應(yīng)、興奮性毒性、自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化等(Tator,1998)，其中，炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素，但其產(chǎn)生機(jī)制還不完全清楚。

3、在SCI后，細(xì)胞損傷及毒性物質(zhì)可迅速誘發(fā)固有免疫應(yīng)答，而CNS內(nèi)固有的小膠質(zhì)細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答的重要組成部分。小膠質(zhì)細(xì)胞靜息狀態(tài)下，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystemCNS)中起著監(jiān)視作用，脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活并發(fā)生明顯的形態(tài)變化，從靜息多分支樣轉(zhuǎn)變成活化的變形蟲(chóng)樣(Kreutzberg,1996;LiuandHong,2003;Streitetal.,1988,1999)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后能夠釋放許多

4、可溶性分子，并促進(jìn)炎癥反應(yīng)，具有潛在的細(xì)胞毒性(如表1所示)。而且小膠質(zhì)細(xì)胞表面的分子在其激活后也發(fā)生顯著的變化(Graeberetal.,1988;OehmichenandGencic,1975)。其中2003年研究報(bào)道Toll樣受體(Tolllikereceptor,TLR)4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞(Lehnardt,2003)，在CNS固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)中均扮演著重要角色，近年來(lái)的研究開(kāi)始關(guān)注TLRs在脊髓

5、損傷中作用，但利用TLRs基因突變?cè)隗w內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論并不一致(Kigerl,2007;Lehnardt,etal.,2003;Schonberg,2007)，為了明確TLRs與SCI后繼發(fā)性損傷的關(guān)系，我們?cè)O(shè)計(jì)的試驗(yàn)分為兩部分旨在研究脊髓損傷后TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的變化，以及其在脊髓損傷中的作用。
　　第一部分研究了脊髓擠壓傷后各時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)變化及其與損傷面積和免疫球蛋白G滲出范圍的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)在成年雄

6、性SD大鼠建立T8節(jié)段脊髓擠壓傷模型；然后一半假手術(shù)對(duì)照組及擠壓傷組動(dòng)物在手術(shù)后0h、3h、24h、72h和7d用4％多聚甲醛灌注固定，取以擠壓點(diǎn)為中心的2cm脊髓，冰凍切片后進(jìn)行H-E染色和免疫熒光染色，分別觀察損傷面積的變化、Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)和TLR4陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的分布，以及與血漿免疫球蛋白G(IgG)滲出范圍的比較，并用IPP軟件計(jì)算各組的陽(yáng)性數(shù)目。結(jié)果表明，脊髓損傷后TLR4主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞，在3h-24h

7、之間開(kāi)始表達(dá)，傷后在72h達(dá)到高峰，7d時(shí)已經(jīng)顯著下降。陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的分布與IgG滲出范圍一致。另外做一批假手術(shù)對(duì)照組及擠壓傷0h、3h、24h、72h和7d手術(shù)組，分別在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行麻醉、斷頭取材，提取總RNA，進(jìn)行TLR4的RT-PCR及real-timePCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在mRNA水平TLR4表達(dá)在3h與正常組沒(méi)有差異，在72h達(dá)到高峰，7d明顯下降。與H.E.染色顯示的脊髓損傷面積變化的時(shí)程相一致，提示大鼠脊髓擠壓傷模型中，

8、表達(dá)在脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞上的TLR4可在脊髓繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分研究了TLRs在脊髓繼發(fā)性損傷中的作用。本實(shí)驗(yàn)同樣采用16只成年雄性SD大鼠建立T8節(jié)段脊髓擠壓傷模型，并于擠壓傷后在脊髓損傷中心緩慢注射TLRs信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子MyD88的抑制劑(MyD88inhibitorpeptide,MIP)5ul或緩慢注射對(duì)照肽(controlpeptide,CP)5ul，并分別用浸有5ulMIP和5ulCP的明膠海綿覆

9、蓋損傷區(qū)，每組各4只，在7d時(shí)用4％多聚甲醛灌注固定，取以擠壓點(diǎn)為中心的2cm脊髓，冰凍切片后進(jìn)行H-E染色和免疫熒光染色。每組另4只在7d斷頭活取以擠壓傷為中心的2cm脊髓，進(jìn)行制樣以作P-P38MAPK，IL-1，TNF-α及caspase-3的westernblot試驗(yàn)。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，用BBB評(píng)分及beam-walking試驗(yàn)觀察對(duì)照組于給藥組在行為學(xué)上的差別。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MIP組使得大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)加快

10、，脊髓組織凋亡細(xì)胞減少。并且凋亡細(xì)胞減少的原因可能是MIP阻礙了炎性因子的產(chǎn)生，這提示TLRs參與了脊髓繼發(fā)性損傷，在早期阻礙TLRs信號(hào)通路能夠減輕繼發(fā)性損傷。
　　綜上所述，我們?cè)诘鞍姿郊癿RNA水平確定了大鼠脊髓擠壓傷后TLR4表達(dá)的時(shí)程變化，并且其與脊髓損傷面積的變化趨勢(shì)一致性提示小膠質(zhì)細(xì)胞可能通過(guò)TLR4途徑參與脊髓繼發(fā)性損傷，在給與TLRs信號(hào)通路的MIP后，脊髓損傷得到較快的修復(fù)。證實(shí)TLRs通過(guò)MyD88信號(hào)途徑