干細胞表面工程化促進梗死心肌再血管化的研究.pdf

1、我們從心肌梗死的生理病理學特點出發(fā)，篩選體內(nèi)具有梗死心肌靶向特點的體內(nèi)固有結(jié)構(gòu)。心肌梗死后最顯著的病理生理學特點是缺血性無菌性炎癥，炎癥細胞滲出和干細胞富集歸巢是心肌梗死組織一個明顯特點。SDF-1/CXCR4軸在間充質(zhì)干細胞趨化，歸巢到梗死心肌中起著重要作用。SDF-1由缺血心肌內(nèi)的細胞分泌并控制MSC的募集。MSC通過其表面上的CXCR4與SDF-1結(jié)合，沿著SDF-1濃度梯度定向遷移到梗死心肌組織。由于MSC源自骨髓，它們具有良好

2、的生物相容性，所以我們提出基于間充質(zhì)干細胞歸巢特性的VEGF遞送系統(tǒng)。
　　如何利用干細胞的歸巢特性攜帶VEGF等生物分子遞送梗死心肌成為重要的科學問題。以往的研究主要通過VEGF基因修飾干細胞或者干細胞內(nèi)攜帶VEGF納米粒子的方式，但是這些方式有可能影響干細胞的生物活性、歸巢性、生物安全性。我們提出“干細胞表面工程化的方式負載遞送VEGF”的方式來規(guī)避對干細胞的影響，實現(xiàn)VEGF的靶向遞送，促進梗死心肌再血管化進程。
　　

3、干細胞表面工程化是根據(jù)間充質(zhì)干細胞膜表面特點進行表面接枝的工程手段。干細胞細胞膜表面的特點有1）磷脂雙分子層所具有的細胞膜表面負電荷層;2）細胞膜磷脂雙分子具有的親脂性特性;3）細胞膜表面具有的生物分子（糖被和蛋白類）。根據(jù)干細胞表面特點可以將間充質(zhì)干細胞表面工程化分為:1）正負電荷聚電解質(zhì)的層層自組裝;2）親疏水性的自組裝方式;3）根據(jù)抗原抗體反應的接枝方式;4）根據(jù)表面特點進行適配子方式的偶聯(lián)接枝方式;5）使用化學方式的化學交聯(lián)接枝

4、方式。第3，4種方式具有免疫原性的問題和第5種方式具有較差的生物相容性問題。為了減少對干細胞的影響和較好的生物相容性，所以采用前兩種方式。我們選擇使用疏水性接枝和靜電相互作用的方式負載VEGF構(gòu)建細胞膜工程化的心肌梗死藥物遞送系統(tǒng)。由于心梗組織免疫炎癥的不良微環(huán)境，導致歸巢到心肌梗死區(qū)域的表面工程化干細胞被清除和較低存活率，從而影響VEGF在心梗區(qū)域的持續(xù)釋放和再血管化進程。如何改善心肌梗死組織微環(huán)境成為促進表面工程化干細胞持續(xù)存在、緩

5、釋VEGF促進梗死心肌組織再血管化的重要考慮。
　　促進梗死心肌再血管化（內(nèi)皮祖細胞移植、干細胞表面工程化負載VEGF兩種方式）都需要改善梗死心肌組織的免疫炎癥微環(huán)境，同時改善心梗區(qū)域不良微環(huán)境也成為心肌梗死治療的重點和基礎。過去十年，許多的研究集中在生物工程、生物材料上，以改善干細胞的生存微環(huán)境，最終保護心臟功能。一種可能的策略涉及提供替代的細胞外基質(zhì)使細胞集中于遞送部位的生物材料。脾臟在胚胎時期是重要的造血器官，出生之后是人體

6、最大的免疫器官和大量干細胞寄居器官。大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)，脾臟細胞外基質(zhì)對于干細胞的存活、旁分泌、分化等多種功能和免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)控具有重要的作用。我們提出假設:脾臟細胞外基質(zhì)可以提高干細胞歸巢后的存活，進而實現(xiàn)改善心功能。為此我們制備了溫敏性脾臟細胞外基質(zhì)水凝膠，其溫敏性特點（常溫下液體，在體內(nèi)37℃情況下自組裝成水膠）是可以用作微創(chuàng)方式遞送至心肌，具有較好的臨床使用方便性。
　　因此，我們從四個方面深入研究干細胞表面工程化在促進梗死

7、心肌再血管化的作用。
　　一、干細胞自組裝在心肌梗死組織再血管化的研究
　　我們開發(fā)了一種針對心梗區(qū)域的VEGF遞送系統(tǒng)，此方法基于層層自組裝以后MSC細胞仍然存有歸巢特性，從而改善了心梗區(qū)域血管生成以及心功能。結(jié)果顯示，體外實驗中層層自組裝VEGF包裹的MSC細胞能夠持續(xù)釋放VEGF，并且具有SDF-1趨化性;體內(nèi)實驗證明，負載VEGF層層自組裝的MSC能夠歸巢到心梗區(qū)域，促進梗死區(qū)域再血管化、改善心功能。這些實驗結(jié)果揭示

8、:應用層層自組裝包裹VEGF到MCS細胞可能有望成為無創(chuàng)治療心梗的手段。與其他藥物遞送系統(tǒng)相對比來說，這種負載VEGF層層自組裝MSC的藥物遞送系統(tǒng)有如下優(yōu)點:1、MSC是體內(nèi)固有細胞，因其良好的生物相容性，已經(jīng)被用于細胞治療以及藥物遞送;2、藥物通過層層自組裝被物理包裹在MSC的表面，實驗證明能夠持續(xù)釋放藥物，并且擁有良好的藥物動力學效果;3、通過層層自組裝包裹其他藥物到MSC表面，可能有望成為治療其他疾病的有效方法。
　　二、

9、干細胞接枝促進歸巢效率、保持VEGF生物活性的研究
　　層層自組裝負載VEGF的間充質(zhì)干細胞由于層狀的包裹影響趨化因子與間充質(zhì)干細胞表面的受體結(jié)合，從而減弱了間充質(zhì)干細胞的歸巢能力和藥物遞送效率。本部分的研究目的是為了改善層層自組裝負載VEGF的MSC歸巢性，提高VEGF生物活性，我們首次制備了DMPE-PEG-Heparin接枝的MSC。實驗結(jié)果顯示，雙親性的DMPE-PEG-Heparin能通過其親脂性接枝到間充質(zhì)干細胞細胞膜

10、的磷脂雙分子層上。趨化因子、黏附因子與間充質(zhì)干細胞表面的受體結(jié)合是間充質(zhì)干細胞的定向歸巢的基礎。鏈狀接枝方式而非層狀的自組裝聚電解質(zhì)層更有助于保持間充質(zhì)干細胞的歸巢性能，層狀的自組裝聚電解質(zhì)層可能是通過影響趨化因子與間充質(zhì)干細胞膜受體的結(jié)合進而削弱層層自組裝MSC的定向遷移能力。體外實驗結(jié)果表明肝素/VEGF的方式負載VEGF具有持續(xù)性的緩釋能力，提高了VEGF在心梗區(qū)域的半衰期。這對于心梗修復過程中需要長時間的VEGF作用具有重要意義

11、。
　　三、脾臟細胞外基質(zhì)水凝膠改善心肌梗死免疫微環(huán)境的機制研究
　　目前促進心肌梗死組織再血管化的研究主要集中在干細胞移植和促進血管新生分子兩種方式。雖然內(nèi)皮祖細胞等干細胞可以分化為內(nèi)皮細胞或旁分泌從而有效地促進心梗區(qū)域再血管化進程，但是由于心肌梗死組織免疫炎癥性微環(huán)境的病理生理學特點，導致較低的干細胞存活率和再血管化的障礙。目前，如何改善心肌梗死組織微環(huán)境成為促進內(nèi)皮祖細胞等干細胞移植的重點。
　　在前兩部分的研究

12、中，我們成功構(gòu)建了具有心梗靶向功能、負載VEGF的層層自組裝的間充質(zhì)干細胞和DMPE-PEG-肝素接枝的間充質(zhì)干細胞。表面工程化的間充質(zhì)干細胞具有歸巢和遞送VEGF至心梗區(qū)域參與心梗后修復、改善心肌梗死區(qū)域再血管化、提高心梗后心功能的作用。但是當表面工程化的間充質(zhì)干細胞到達梗死區(qū)域后，由于不良的梗死區(qū)域微環(huán)境將導致歸巢的間充質(zhì)干細胞死亡、被免疫系統(tǒng)清除，從而影響藥物遞送系統(tǒng)持續(xù)地緩釋VEGF等藥物。如何改善心肌梗死微環(huán)境從而避免免疫炎癥

13、系統(tǒng)對表面工程化的間充質(zhì)干細胞的清除成為研究的重要方向。
　　在心肌梗死病理生理過程中，免疫系統(tǒng)起著非常關鍵的作用。心肌梗死區(qū)域免疫微環(huán)境的惡化是影響心肌梗死再血管化、心功能恢復的重要障礙，如何改善心肌梗死組織免疫微環(huán)境成為重要的靶點和科學問題。過去十年，許多的研究集中在生物工程生物材料上，以改善干細胞的遞送和移植微環(huán)境，最終改善心功能。常用的策略是利用細胞外基質(zhì)材料包裹移植，從而改善干細胞移植的微環(huán)境。脾臟是人體中最大的免疫器官

14、，并且脾臟組織的細胞外基質(zhì)在免疫細胞、淋巴生成、免疫平衡等功能過程中起著重要作用。因此，我們提出了一個假設:由脾臟組織的細胞外基質(zhì)經(jīng)過脫細胞后制備的凝膠可能會通過優(yōu)化心肌梗死區(qū)域的微環(huán)境來增強心臟功能。在這個研究中，我們發(fā)明了一種由脾臟組織的細胞外基質(zhì)經(jīng)過脫細胞而制成的溫敏性水凝膠，當注射到體內(nèi)時，它可以表現(xiàn)出自組裝呈凝膠狀的特點。研究結(jié)果顯示，脾臟水凝膠包含多種結(jié)構(gòu)域和成分，這些結(jié)構(gòu)域和成分可以影響免疫功能，改善心梗組織免疫微環(huán)境。在

15、體內(nèi)，脾臟水凝膠能夠促進單核細胞的發(fā)育和淋巴管生成，從而加強心肌梗死后的心臟功能，我們的研究結(jié)果表明通過免疫生物材料來改善免疫微環(huán)境有可能成為用于微創(chuàng)治療心肌梗死的新技術。
　　四、脾臟細胞外基質(zhì)水凝膠通過提高干細胞促進梗死心肌再血管化、改善心功能的研究
　　在前兩部分的研究中，我們成功構(gòu)建了具有心梗靶向功能、負載VEGF的層層自組裝的間充質(zhì)干細胞和DMPE-PEG-肝素接枝的間充質(zhì)干細胞。第三部分成功制備脾臟細胞外基質(zhì)水凝

16、膠，結(jié)果顯示脾臟細胞外基質(zhì)水凝膠具有調(diào)控免疫微環(huán)境的作用。進一步，我們研究脾臟細胞外基質(zhì)水凝膠是否可以提高干細胞在心梗區(qū)域的存活具有重要的意義，將為未來細胞表面工程化的干細胞和細胞治療提供新的策略和工具。
　　脾臟在胚胎時期是重要的造血器官，出生之后是成體干細胞的重要寄居器官。大量的研究表明，脾臟細胞外基質(zhì)對于干細胞的存活、旁分泌、分化等多種功能具有重要的作用。由于EPC的易于分離培養(yǎng)和促進血管新生的特點，是干細胞治療的重要細胞，