超聲輻照微泡誘導(dǎo)心肌微環(huán)境改變聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)梗死心肌血管新生研究.pdf

1、干細(xì)胞移植是治療心肌梗死的一種非常有前景的新方法。在特定的微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或者心肌細(xì)胞，并分泌血管生長(zhǎng)因子，促進(jìn)心肌血管生成，改善心臟功能。心肌微環(huán)境對(duì)于移植干細(xì)胞的存活、遷移、分化，以及能否有效發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)起決定性作用。急性心肌梗死經(jīng)干細(xì)胞移植治療后，移植干細(xì)胞在梗死區(qū)會(huì)因?yàn)槿毖?再灌注損傷、炎性因子等惡劣環(huán)境的作用而大量死亡，將極大的影響干細(xì)胞的療效。因此，改善局部微環(huán)境使之更適合干細(xì)胞的存活及發(fā)揮效用

2、，是目前重要的研究方向。
　　 超聲對(duì)生物組織細(xì)胞有特定的生物學(xué)效應(yīng)，這種生物學(xué)效應(yīng)在加入微泡造影劑后變得更為明顯。研究表明，超聲輻照破壞微泡后，可使細(xì)胞膜通透性增加，微血管破裂，血管內(nèi)皮間隙增寬，并可刺激內(nèi)源性的血管生長(zhǎng)因子分泌增加，促進(jìn)血管新生。超聲輻照微泡后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)可使組織微環(huán)境發(fā)生改變，超聲破壞微泡可產(chǎn)生炎性反應(yīng)，適度的炎性反應(yīng)有助于干細(xì)胞的動(dòng)員及歸巢，但過(guò)度的炎性反應(yīng)將導(dǎo)致干細(xì)胞凋亡及壞死，不利于干細(xì)胞的治療。

3、不同的超聲輻照條件將產(chǎn)生不一致的生物學(xué)效應(yīng)，在一定的條件下甚至導(dǎo)致心肌內(nèi)出血及心肌細(xì)胞壞死。因此，超聲輻照微泡的條件需要優(yōu)化，使之促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子及趨化因子表達(dá)，又不至于產(chǎn)生過(guò)度的炎性反應(yīng)及心肌細(xì)胞壞死。
　　 基于上述理論及存在的問(wèn)題，本研究擬觀察不同強(qiáng)度脈沖超聲輻照微泡后對(duì)梗死心肌組織細(xì)胞因子及粘附分子表達(dá)的影響，確定適宜干細(xì)胞移植治療的超聲輻照能量。并在超聲輻照微泡改善心肌微環(huán)境后進(jìn)行干細(xì)胞移植治療，采用冠脈造影、超聲心動(dòng)

4、圖、SPECT等方法觀察心肌灌注、冠脈側(cè)枝循環(huán)形成及心臟射血分?jǐn)?shù)改善情況，采用CD34免疫組織化學(xué)染色，觀察心肌血管新生情況。共包括以下兩個(gè)部分。
　　 第一部分、超聲輻照微泡對(duì)心肌梗死犬心肌微環(huán)境的影響
　　 目的：探討不同強(qiáng)度超聲觸發(fā)破壞微泡對(duì)犬心肌微環(huán)境的影響，確定用利于干細(xì)胞治療的適宜超聲輻照能量。
　　 方法：將20只通過(guò)開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法成功建立心肌梗死的動(dòng)物隨機(jī)分為4組，第1、2、3組犬

5、在心肌梗死1周后通過(guò)靜脈輸入微泡，采用頻率為1MHz，強(qiáng)度分別為1.5W/c㎡、1.0W/c㎡、0.5W/c㎡的脈沖超聲經(jīng)胸壁輻照犬左室前壁，每次輻照10分鐘，每2-3天輻照1次，累計(jì)輻照3次。第4組犬不采用超聲輻照，作為對(duì)照組。第3次輻照后將犬處死，取左室前壁梗死周邊區(qū)域心肌組織，通過(guò)HE染色，定量PCR、Western Blot及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-1β，VACM-1，SDF1，VEGF mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　

6、 結(jié)果：定量PCR結(jié)果顯示采用頻率為1MHz，強(qiáng)度為1.5W/c㎡的超聲輻照組心肌組織表達(dá)VEGF、VACM-1、SDF-1較對(duì)照組增加約5倍，IL-1β較對(duì)照組增加9倍；1.0W/c㎡組表達(dá)VEGF、VACM-1，SDF-1較對(duì)照組增加約3.8～4.7倍，IL-1β較對(duì)照組增加4.7倍；0.5W/c㎡組表達(dá)VEGF、VACM-1、SDF-1、IL-1β與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示采用1.0W/c㎡、

7、1.5W/c㎡超聲輻照組犬心肌組織表達(dá)IL-1β，VACM-1，SDF1，VEGF較0.5W/c㎡組及對(duì)照組明顯增加，1.5W/c㎡組表達(dá)IL-1β較1.0W/c㎡組明顯增加。
　　 結(jié)論：頻率為1MHz，強(qiáng)度為1.0W/c㎡的超聲靶向破壞微泡可促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子及趨化因子的表達(dá)，而不引起嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，有利于干細(xì)胞的歸巢及分化。
　　 第二部分、超聲輻照微泡誘導(dǎo)心肌微環(huán)境改變聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)梗死心肌血管新生研

8、究
　　 第一節(jié) 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：探討一種可靠、純度高的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）體外提取分離、純化、培養(yǎng)和鑒定的方法。
　　 方法：采用骨髓穿刺獲得骨髓干細(xì)胞，應(yīng)用密度為1.073 g/ml的Percoll分離液，通過(guò)密度梯度離心法分離出犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法獲得純度高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白CD29、CD31、CD3

9、4、CD44、CD45和vWF的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)犬BM-MSCs進(jìn)行周期測(cè)定。
　　 結(jié)果：分離的犬干細(xì)胞CD29、CD44均呈陽(yáng)性表達(dá)，CD31、CD34、CD45和vWF的表達(dá)為陰性；88.88％的細(xì)胞處在G0/G1期；由此證明所分離的細(xì)胞為犬BMMSCs，2周內(nèi)經(jīng)3代培養(yǎng)即可擴(kuò)增到107細(xì)胞數(shù)量級(jí)，純度可達(dá)到99％以上。
　　 結(jié)論：通過(guò)密度為1.073g/ml的Percoll分離液篩選分離出的骨髓單個(gè)核細(xì)胞

10、，經(jīng)貼壁培養(yǎng)后可在短期內(nèi)獲得高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可為治療犬的心肌梗死提供充足的細(xì)胞來(lái)源。
　　 第二節(jié) 超聲靶向破壞微泡誘導(dǎo)心肌微環(huán)境改變聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)梗死犬心肌血管新生的影響
　　 目的：探討超聲靶向破壞微泡改變誘導(dǎo)心肌微環(huán)境后對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死療效的影響。
　　 方法：將通過(guò)開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法成功建立心肌梗死模型的15只犬，隨機(jī)分A、B、C3組，A組犬在梗死一周后，

11、采用頻率為1MHz，強(qiáng)度為1.0W/c㎡的脈沖超聲經(jīng)胸壁輻照犬左室前壁，并同時(shí)靜脈輸入微泡，每2-3天輻照一次，輻照方法同前。B組及C組犬不采用超聲輻照。在第3次輻照后10分鐘后，通過(guò)介入方法，經(jīng)冠狀動(dòng)脈注入自體來(lái)源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，B組犬也通過(guò)冠脈注入同等劑量自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，C組犬行冠脈造影檢查，注入同等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。A、B、C3組犬均在冠脈造影前行超聲及ECT檢查評(píng)價(jià)心肌功能及心肌灌注情況。繼續(xù)飼養(yǎng)1月后，對(duì)A、B、C3組

12、犬復(fù)查冠脈造影、超聲心動(dòng)圖及ECT，并采用CD34免疫組織化學(xué)染色，觀察心肌血管新生情況。
　　 結(jié)果：采用超聲靶向破壞微泡聯(lián)合干細(xì)胞移植組犬，在心肌組織灌注，冠脈側(cè)枝循環(huán)及血管新生等方面均明顯優(yōu)于單純干細(xì)胞移植組及對(duì)照組，超聲靶向破壞微泡+干細(xì)胞移植組犬左室射血分?jǐn)?shù)改善明顯優(yōu)于單純干細(xì)胞移植組及對(duì)照組（69.8±4.62％vs60.7±9.18％vs52.5±3.73％，P<0.05）。
　　 結(jié)論：超聲靶向破壞微泡誘