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文檔簡介
1、干細胞移植是治療心肌梗死的一種非常有前景的新方法。在特定的微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞可分化為血管內(nèi)皮細胞或者心肌細胞,并分泌血管生長因子,促進心肌血管生成,改善心臟功能。心肌微環(huán)境對于移植干細胞的存活、遷移、分化,以及能否有效發(fā)揮生物學效應起決定性作用。急性心肌梗死經(jīng)干細胞移植治療后,移植干細胞在梗死區(qū)會因為缺血/再灌注損傷、炎性因子等惡劣環(huán)境的作用而大量死亡,將極大的影響干細胞的療效。因此,改善局部微環(huán)境使之更適合干細胞的存活及發(fā)揮效用
2、,是目前重要的研究方向。
超聲對生物組織細胞有特定的生物學效應,這種生物學效應在加入微泡造影劑后變得更為明顯。研究表明,超聲輻照破壞微泡后,可使細胞膜通透性增加,微血管破裂,血管內(nèi)皮間隙增寬,并可刺激內(nèi)源性的血管生長因子分泌增加,促進血管新生。超聲輻照微泡后產(chǎn)生的生物學效應可使組織微環(huán)境發(fā)生改變,超聲破壞微泡可產(chǎn)生炎性反應,適度的炎性反應有助于干細胞的動員及歸巢,但過度的炎性反應將導致干細胞凋亡及壞死,不利于干細胞的治療。
3、不同的超聲輻照條件將產(chǎn)生不一致的生物學效應,在一定的條件下甚至導致心肌內(nèi)出血及心肌細胞壞死。因此,超聲輻照微泡的條件需要優(yōu)化,使之促進血管生長因子及趨化因子表達,又不至于產(chǎn)生過度的炎性反應及心肌細胞壞死。
基于上述理論及存在的問題,本研究擬觀察不同強度脈沖超聲輻照微泡后對梗死心肌組織細胞因子及粘附分子表達的影響,確定適宜干細胞移植治療的超聲輻照能量。并在超聲輻照微泡改善心肌微環(huán)境后進行干細胞移植治療,采用冠脈造影、超聲心動
4、圖、SPECT等方法觀察心肌灌注、冠脈側(cè)枝循環(huán)形成及心臟射血分數(shù)改善情況,采用CD34免疫組織化學染色,觀察心肌血管新生情況。共包括以下兩個部分。
第一部分、超聲輻照微泡對心肌梗死犬心肌微環(huán)境的影響
目的:探討不同強度超聲觸發(fā)破壞微泡對犬心肌微環(huán)境的影響,確定用利于干細胞治療的適宜超聲輻照能量。
方法:將20只通過開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法成功建立心肌梗死的動物隨機分為4組,第1、2、3組犬
5、在心肌梗死1周后通過靜脈輸入微泡,采用頻率為1MHz,強度分別為1.5W/c㎡、1.0W/c㎡、0.5W/c㎡的脈沖超聲經(jīng)胸壁輻照犬左室前壁,每次輻照10分鐘,每2-3天輻照1次,累計輻照3次。第4組犬不采用超聲輻照,作為對照組。第3次輻照后將犬處死,取左室前壁梗死周邊區(qū)域心肌組織,通過HE染色,定量PCR、Western Blot及免疫組織化學法檢測IL-1β,VACM-1,SDF1,VEGF mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平。
6、 結(jié)果:定量PCR結(jié)果顯示采用頻率為1MHz,強度為1.5W/c㎡的超聲輻照組心肌組織表達VEGF、VACM-1、SDF-1較對照組增加約5倍,IL-1β較對照組增加9倍;1.0W/c㎡組表達VEGF、VACM-1,SDF-1較對照組增加約3.8~4.7倍,IL-1β較對照組增加4.7倍;0.5W/c㎡組表達VEGF、VACM-1、SDF-1、IL-1β與對照組相比無統(tǒng)計學差異。Western Blot檢測結(jié)果顯示采用1.0W/c㎡、
7、1.5W/c㎡超聲輻照組犬心肌組織表達IL-1β,VACM-1,SDF1,VEGF較0.5W/c㎡組及對照組明顯增加,1.5W/c㎡組表達IL-1β較1.0W/c㎡組明顯增加。
結(jié)論:頻率為1MHz,強度為1.0W/c㎡的超聲靶向破壞微泡可促進血管生長因子及趨化因子的表達,而不引起嚴重的炎性反應,有利于干細胞的歸巢及分化。
第二部分、超聲輻照微泡誘導心肌微環(huán)境改變聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植促進梗死心肌血管新生研
8、究
第一節(jié) 犬骨髓間充質(zhì)干細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定
目的:探討一種可靠、純度高的犬骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)體外提取分離、純化、培養(yǎng)和鑒定的方法。
方法:采用骨髓穿刺獲得骨髓干細胞,應用密度為1.073 g/ml的Percoll分離液,通過密度梯度離心法分離出犬骨髓單個核細胞,應用貼壁培養(yǎng)法獲得純度高的骨髓間充質(zhì)干細胞,應用細胞免疫組織化學檢測細胞表面標記蛋白CD29、CD31、CD3
9、4、CD44、CD45和vWF的表達,應用流式細胞儀對犬BM-MSCs進行周期測定。
結(jié)果:分離的犬干細胞CD29、CD44均呈陽性表達,CD31、CD34、CD45和vWF的表達為陰性;88.88%的細胞處在G0/G1期;由此證明所分離的細胞為犬BMMSCs,2周內(nèi)經(jīng)3代培養(yǎng)即可擴增到107細胞數(shù)量級,純度可達到99%以上。
結(jié)論:通過密度為1.073g/ml的Percoll分離液篩選分離出的骨髓單個核細胞
10、,經(jīng)貼壁培養(yǎng)后可在短期內(nèi)獲得高純度的骨髓間充質(zhì)干細胞,可為治療犬的心肌梗死提供充足的細胞來源。
第二節(jié) 超聲靶向破壞微泡誘導心肌微環(huán)境改變聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植對梗死犬心肌血管新生的影響
目的:探討超聲靶向破壞微泡改變誘導心肌微環(huán)境后對骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療心肌梗死療效的影響。
方法:將通過開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法成功建立心肌梗死模型的15只犬,隨機分A、B、C3組,A組犬在梗死一周后,
11、采用頻率為1MHz,強度為1.0W/c㎡的脈沖超聲經(jīng)胸壁輻照犬左室前壁,并同時靜脈輸入微泡,每2-3天輻照一次,輻照方法同前。B組及C組犬不采用超聲輻照。在第3次輻照后10分鐘后,通過介入方法,經(jīng)冠狀動脈注入自體來源骨髓間充質(zhì)干細胞,B組犬也通過冠脈注入同等劑量自體骨髓間充質(zhì)干細胞,C組犬行冠脈造影檢查,注入同等體積的細胞培養(yǎng)液。A、B、C3組犬均在冠脈造影前行超聲及ECT檢查評價心肌功能及心肌灌注情況。繼續(xù)飼養(yǎng)1月后,對A、B、C3組
12、犬復查冠脈造影、超聲心動圖及ECT,并采用CD34免疫組織化學染色,觀察心肌血管新生情況。
結(jié)果:采用超聲靶向破壞微泡聯(lián)合干細胞移植組犬,在心肌組織灌注,冠脈側(cè)枝循環(huán)及血管新生等方面均明顯優(yōu)于單純干細胞移植組及對照組,超聲靶向破壞微泡+干細胞移植組犬左室射血分數(shù)改善明顯優(yōu)于單純干細胞移植組及對照組(69.8±4.62%vs60.7±9.18%vs52.5±3.73%,P<0.05)。
結(jié)論:超聲靶向破壞微泡誘
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