XBFD組分配伍激活CTL誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)方法實(shí)現(xiàn)小半夏加茯苓湯效用組分的配比優(yōu)化。研究小半夏加茯苓湯(Xiaobanxia-Fuling Decoction，XBFD)及其效用組分配伍對(duì)H22荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用、免疫調(diào)節(jié)作用以及激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxi TLymphocytes，CTL)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，并深度探討該方及其效用組分配伍于體內(nèi)誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)通路因子，為XBFD進(jìn)一步用于腫瘤放化療的輔助及

2、預(yù)后改善治療提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:建立H22荷瘤小鼠模型，將100只小鼠隨機(jī)分為5組，按照均勻設(shè)計(jì)法要求給予不同配比的半夏生物堿、茯苓多糖及姜辣素。連續(xù)給藥10d后，次日處死。運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)方法，以瘤重為療效指標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。得到最優(yōu)配比后，另增原方湯劑組、順鉑組、模型組和空白對(duì)照組各一組，將100只小鼠隨機(jī)分.為5組，連續(xù)給藥10d后，次日處死。計(jì)算抑瘤率，檢測(cè)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用，對(duì)最優(yōu)配比組方療效進(jìn)行驗(yàn)證。運(yùn)

3、用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)荷瘤小鼠移植瘤中顆粒酶A、B、C，Bax和Bcl-2，Apaf-1以及Caspase-3和Caspase-8基因的表達(dá)情況;通過(guò)HE染色法顯示移植瘤細(xì)胞形態(tài)，驗(yàn)證模型造模成功;TUNEL染色法顯示凋亡腫瘤細(xì)胞形態(tài);免疫組織化學(xué)法測(cè)定顆粒酶B、Bax和Bcl-2的表達(dá)情況;免疫熒光技術(shù)檢測(cè)凋亡腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和Caspase-3、細(xì)胞色素C和Apaf-1的表達(dá)情況;采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行

4、統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:1.均勻設(shè)計(jì)方法優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證:通過(guò)均勻設(shè)計(jì)方法得到瘤重回歸方程(y=0.556+0.06A+2.091B-0.271 C)，其中當(dāng)組方中茯苓多糖為0.005 mg、姜辣素為0.195 mg時(shí)瘤重最低。最優(yōu)配比組方可反映原方湯劑的療效，對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)發(fā)揮一定的抑制作用;同時(shí)與順鉑組相比，可提高小鼠免疫器官指數(shù)及血清中TNF-α、ID2的濃度。
　　2.RT-PCR結(jié)果:與模型組比較，復(fù)方組及順鉑組的Ba

5、x表達(dá)量均有升高(p＜0.05);最優(yōu)組分配比組、復(fù)方組Bcl-2表達(dá)量明顯降低(p＜0.05)，順鉑組顯著降低(p＜0.01）;復(fù)方組Caspase-3表達(dá)量升高(p＜0.05)，最優(yōu)組分配比組Caspase-8表達(dá)量升高(p＜0.05);復(fù)方組、順鉑組Apaf-1表達(dá)量明顯升高(p＜0.05)，最優(yōu)組分配比組顯著升高(p＜0.01）;最優(yōu)組分配比組顆粒酶A表達(dá)量顯著降低(p＜0.01)，顆粒酶B表達(dá)量升高(p＜0.05)，顆粒酶C表

6、達(dá)量降低(p＜0.05);復(fù)方組與順鉑組顆粒酶A表達(dá)量降低，顆粒酶B表達(dá)量升高(p＜0.05)。
　　3.TUNEL染色法結(jié)果:陽(yáng)性著色為棕黃色顆粒，主要分布于瘤細(xì)胞的細(xì)胞核上，各給藥組較模型組，均有助于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(p＜0.05)，其中復(fù)方組及順鉑組具有顯著意義(p＜0.01）。
　　4.免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果:Bax、Bcl-2、顆粒酶B陽(yáng)性著色為棕黃色顆粒，主要分布于瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿上，各給藥組較模型組，顆粒酶B與B

7、ax表達(dá)上調(diào)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。
　　5.免疫熒光染色法結(jié)果:紅色熒光為Apaf-1、Caspase-3陽(yáng)性熒光顯色表達(dá)，綠色熒光為CytoC陽(yáng)性熒光顯色表達(dá)及腫瘤細(xì)胞凋亡的陽(yáng)性熒光顯色表達(dá)，主要分布于瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿上，各給藥組較模型組，Apaf-1、Cyto C與Caspase-3表達(dá)上調(diào)，各給藥組均有益于腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:經(jīng)過(guò)均勻設(shè)計(jì)法確定XBFD效用組分用量的優(yōu)化配比，組方具有腫瘤抑制及免