組分配伍與藥劑學(xué)技術(shù)應(yīng)用對(duì)蛇床子素生物有效性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、蛇床子素是中藥蛇床子中一種香豆素類(lèi)活性化合物，具有解痙、降血壓、抗心律失常、增強(qiáng)免疫功能、抗癌、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗凋亡、抗過(guò)敏等多種藥理活性。最新研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素對(duì)大鼠酒精性脂肪肝的治療具有較好的療效。蛇床子素屬生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)中Ⅱ類(lèi)藥物，其疏水性較強(qiáng)，水中溶解度低，導(dǎo)致其低溶出率和較低的體內(nèi)生物利用度，從而限制了其臨床應(yīng)用。本課題提出不僅藥劑學(xué)技術(shù)應(yīng)用可改善和提高藥物生物利用度，合理的組方配伍也能改善藥物的溶解度從而提高生物利用

2、度。組分配伍的合理性表現(xiàn)在協(xié)同增效、配伍減毒或減毒增效上，而且也可能表現(xiàn)在藥代動(dòng)力學(xué)特征及體內(nèi)過(guò)程中。
　　藥劑學(xué)技術(shù)常被用于改善難溶性藥物的溶解度，基于蛇床子素物理化學(xué)及生物藥劑學(xué)特征的研究，迄今為止，有關(guān)提高蛇床子素溶出度與生物利用度的研究較少，主要集中于環(huán)糊精包合技術(shù)、乳化技術(shù)、脂質(zhì)體制備技術(shù)、傳統(tǒng)的固體分散技術(shù)、非離子囊泡技術(shù)以及其他半合成結(jié)構(gòu)改造方法等。目前，僅有環(huán)糊精包合技術(shù)，以體外和體內(nèi)相結(jié)合的方法較系統(tǒng)地研究了增加

3、蛇床子素溶解度從而改善其體內(nèi)生物利用度的報(bào)道。本課題選擇新型固體分散介質(zhì)，應(yīng)用熱熔擠出技術(shù)制備蛇床子素固體分散體。與傳統(tǒng)固體分散體制備方法相比，熱熔擠出可連續(xù)操作，操作過(guò)程沒(méi)有有機(jī)溶劑，無(wú)需干燥，有利于大工業(yè)生產(chǎn)。熱熔擠出過(guò)程中強(qiáng)力的攪拌和攪動(dòng)阻止了藥物的聚集，有利于藥物以較小的粒子均勻分散于載體中。本課題采用體外物化表征和體內(nèi)生物利用度研究，選擇合適的輔料改善蛇床子素溶解度，從而提高其體內(nèi)生物利用度
　　合理的組方配伍也能改善藥

4、物的藥效并提高生物利用度。組分配伍的合理性主要體現(xiàn)在藥理學(xué)和生物藥劑學(xué)環(huán)節(jié)—主要活性成分生物利用度的相互影響以及吸收、分布、代謝、排泄環(huán)節(jié)的相互影響。甘草酸是中藥甘草的主要活性成分，結(jié)構(gòu)為脂溶性的三萜苷元連接水溶性的2個(gè)葡萄糖醛酸，與環(huán)糊精很相似。文獻(xiàn)研究表明，甘草酸可以與很多疏水性化合物形成復(fù)合物，類(lèi)似于環(huán)糊精把疏水性化合物包合在空腔中，從而增加溶解度;其次，甘草酸具有抗炎和肝保護(hù)作用，合用可能提高蛇床子素溶解度的同時(shí)，在藥理學(xué)可能表

5、現(xiàn)出協(xié)同作用，在吸收、分布、代謝、排泄環(huán)節(jié)可能存在相互作用。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，甘草酸和蛇床子素配伍用藥后，肝組織病理切片結(jié)果顯示配伍后能顯著改善蛇床子素治療酒精性脂肪肝療效，對(duì)酒精和高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝具有更好的防治作用。藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，甘草酸配伍后能提高蛇床子素體內(nèi)生物利用度。因此，本課題選用甘草酸與蛇床子素配伍，從藥理學(xué)角度和生物藥劑學(xué)角度闡明二者配伍的合理性。
　　蛇床子素的基本性質(zhì)進(jìn)行了研究結(jié)果表明，蛇床子素在正

6、辛醇-水中的表觀(guān)油水分配系數(shù)P為6562.19(logP=3.82)，說(shuō)明其疏水性很強(qiáng)。不同pH范圍內(nèi)的表觀(guān)油水分配系數(shù)研究結(jié)果表明，其P值受溶液的pH值影響不大，提示其在整個(gè)胃腸道均有較好的吸收。采用藥代動(dòng)力學(xué)模型，建立了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定大鼠口服和靜注蛇床子素后血漿中蛇床子素的濃度，該技術(shù)重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確。大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，蛇床子素絕對(duì)生物利用度僅為15.65％。
　　采用熱熔

7、擠出技術(shù)制備蛇床子素固體分散體，通過(guò)藥物溶解度參計(jì)算，初步篩選出Plasdone S-630、HPMC-E5、Eudragit EPO和Soluplus這4種新型輔料，用于熱熔擠出制備固體分散體。差示量熱分析、X-射線(xiàn)衍射分析和紅外光譜用于表征固體分散體的形成，結(jié)合體外溶出度為指標(biāo)，評(píng)價(jià)各載體固體分散體溶出行為。最終選擇Plasdone S-630、HPMC和Eudragit EPO進(jìn)行大鼠體內(nèi)生物利用度評(píng)價(jià)，進(jìn)一步驗(yàn)證載體材料篩選的合

8、理性。結(jié)果表明，與蛇床子素單體相比，僅Plasdone S-630和HPMC制得的固體分散體能顯著提高蛇床子素大鼠體內(nèi)Cmax（～5倍）和AUC（～1.4倍），顯著降低Tmax，而Eudragit EPO并不能改善蛇床子素體內(nèi)生物利用度。蛇床子素適宜的固體分散體分散介質(zhì)為Plasdone S-630和HPMC。
　　組分（成分）配伍的合理不僅可以表達(dá)在藥效作用機(jī)制上，同樣可表達(dá)在生物藥劑學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程中。
　　采用治療性

9、給藥方案，即酒精性脂肪肝模型成功造模后，繼續(xù)造模的同時(shí)給予藥物治療，進(jìn)行了兩者配伍的藥效學(xué)初探，考察了甘草酸與蛇床子素配伍對(duì)酒精性脂肪肝模型的防治作用的最佳比例，結(jié)合各項(xiàng)指標(biāo)綜合分析，結(jié)果選用的最佳比例為蛇床子素中劑量+甘草酸中劑量(1∶2.25)，給藥周期為4周。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)該比例再次進(jìn)行了酒精性脂肪肝模型造模藥效學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，綜合各指標(biāo)分析評(píng)價(jià)，顯示蛇床子素中劑量+甘草酸中劑量(1∶2.25)仍為最優(yōu)，從而對(duì)比例篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果有了

10、較好的驗(yàn)證。
　　通過(guò)大鼠灌胃給藥提取肝組織樣本，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)肝組織脂肪分解通路三種關(guān)鍵蛋白（PPARα、CPT-1、RXRα蛋白)的表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證前期篩選所得甘草酸與蛇床子素配伍最佳比例的合理性，結(jié)果顯示與前期整體動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果一致，表明甘草酸配伍可以增強(qiáng)治療酒精性脂肪肝效果，進(jìn)一步從分子水平驗(yàn)證前期所篩選的蛇床子素中劑量+甘草酸中劑量(1∶2.25)比例的合理性。
　　在藥理學(xué)角度探討了

11、二者配伍增效的機(jī)制基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從生物藥劑學(xué)角度探討了二者配伍的科學(xué)內(nèi)涵。采用大鼠藥代動(dòng)力學(xué)模型比較分析了甘草酸與蛇床子素配伍前后，蛇床子素在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征的變化。結(jié)果表明，配伍后Cmax和AUC0-24h顯著提高(P＜0.05)，提示甘草酸能顯著提高蛇床子素大鼠體內(nèi)生物利用度。本課題采用多種模型研究甘草酸及其體內(nèi)主要水解產(chǎn)物甘草次酸對(duì)蛇床子素體外增溶、及對(duì)其吸收、分布、代謝、排泄的影響，闡明甘草酸提高蛇床子素生物利用度的原因。

12、最后，采用大鼠藥代動(dòng)力學(xué)模型研究了甘草酸體內(nèi)水解產(chǎn)物甘草次酸對(duì)蛇床子素體內(nèi)生物利用度的影響，進(jìn)一步與上述結(jié)果互為補(bǔ)充，確證配伍后蛇床子素體內(nèi)生物利用度的提高的主要原因。
　　體外溶解度實(shí)驗(yàn)研究甘草酸及其水解產(chǎn)物甘草次酸對(duì)蛇床子素溶解度的影響，結(jié)果表明，甘草酸對(duì)蛇床子素有顯著增溶作用，且增溶效應(yīng)與甘草酸濃度成正比，而甘草次酸則不影響蛇床子素溶解度。甘草酸增溶的作用主要與甘草酸的結(jié)構(gòu)有關(guān)，其結(jié)構(gòu)與環(huán)糊精相似。在低溶解度時(shí)，有利于形成包

13、含疏水空腔的環(huán)狀二聚物的結(jié)構(gòu)，這種空腔的存在有利于主客體包合物的形成，與環(huán)糊精相似。此外，甘草酸結(jié)構(gòu)中有疏水部分（三萜烯部分）和親水部分（兩個(gè)葡萄糖醛酸），提示甘草酸可能在水溶液中形成膠束，從而增溶。推測(cè)甘草酸通過(guò)提高蛇床子素溶解度，是蛇床子素體內(nèi)生物利用度提高的一個(gè)原因。
　　采用X-衍射分析和紅外光譜分析探討甘草酸對(duì)蛇床子素的增溶機(jī)制，X-衍射分析結(jié)果表明，蛇床子素在甘草酸中是以無(wú)定型狀態(tài)存在;紅外光譜結(jié)果顯示，甘草酸與蛇床子

14、素之間可能形成氫鍵，二者間存在相互作用。因此，甘草酸增加蛇床子素溶解度的原因可能為蛇床子素在甘草酸中由晶型轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型形式存在，更易于蛇床子素溶解，同時(shí)二者間具有氫鍵作用，從而使得蛇床子素溶解度提高。
　　采用Caco-2模型，研究了蛇床子素在體外的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，以及甘草酸及其體內(nèi)水解產(chǎn)物甘草次酸對(duì)蛇床子素在Caco-2細(xì)胞吸收的影響，結(jié)果表明，蛇床子素吸收較好，甘草酸不能促進(jìn)蛇床子素A測(cè)到B測(cè)的吸收，同時(shí)，甘草酸在體內(nèi)的水解產(chǎn)物

15、甘草次酸亦不能促進(jìn)其吸收。甘草酸提高蛇床子素體內(nèi)生物利用度的原因可能并不是通過(guò)甘草酸和甘草次酸的促吸收作用。
　　采用大鼠體內(nèi)組織分布模型考察了蛇床子素在大鼠體內(nèi)分布的狀況以及甘草酸合用蛇床子素后，藥效顯著增強(qiáng)是否與甘草酸影響蛇床子素體內(nèi)分布有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服蛇床子素單體和蛇床子素+甘草酸配伍給藥后，于胃腸分布最高，經(jīng)胃腸吸收后，迅速分布到不同組織器官中，然后于不同組織器官中快速消除。兩組中各組織的分布總體趨勢(shì)表明，蛇床子素

16、主要分布在肝、脾、腎等血流量豐富的組織。在這三者中，尤以肝臟中最高，提示這與藥效學(xué)方面蛇床子素具有保肝、調(diào)節(jié)肝臟脂代謝、治療酒精性脂肪肝等作用密切相關(guān)。其次為脾、腎組織中較高，這與中醫(yī)上蛇床子入腎、脾經(jīng)相吻合，同時(shí)可能與蛇床子溫腎助陽(yáng)、祛風(fēng)燥濕、增強(qiáng)免疫功能等作用相關(guān)。通過(guò)對(duì)各時(shí)間點(diǎn)蛇床子素在單體組和配伍組中相應(yīng)臟器中分布情況的比較，結(jié)果顯示，甘草酸影響了蛇床子素在體內(nèi)部分組織的分布。甘草酸提高了蛇床子素血液中濃度，推測(cè)可能提高其體內(nèi)生

17、物利用度從而增強(qiáng)藥效;甘草酸對(duì)蛇床子素在脾、腎、胃等組織分布無(wú)顯著性影響，對(duì)心、小腸組織不同時(shí)間點(diǎn)影響不同，甘草酸能增加蛇床子素在肝、肺組織中的分布，提示甘草酸增強(qiáng)蛇床子素治療酒精性脂肪肝的效果可能與甘草酸能顯著提高蛇床子素在肝組織中的分布，使其在肝組織中富集密切相關(guān)。
　　采用大鼠腸S9和肝S9Ⅰ相孵育系統(tǒng)研究了蛇床子素體外代謝的情況，以及甘草酸配伍蛇床子素對(duì)蛇床子素體外代謝的影響，從而考察配伍后蛇床子素生物利用度的升高是否存在

18、代謝環(huán)節(jié)的相互作用。結(jié)果表明，腸S9和肝S9Ⅰ相孵育體系中加入甘草酸和甘草次酸均不減緩蛇床子素代謝，從而說(shuō)明，甘草酸提高蛇床子素體內(nèi)生物利用度的原因可能并非減緩其代謝。
　　采用大鼠體內(nèi)排泄研究了大鼠口服蛇床子素后經(jīng)糞便、尿液排泄情況，以及甘草酸配伍后對(duì)蛇床子素體內(nèi)排泄的影響。結(jié)果表明，蛇床子素單體組24h內(nèi)尿液中累計(jì)排泄量為0.01％，糞便中累計(jì)排泄量為0.25％，說(shuō)明蛇床子素以原型排泄量都不到1％，推測(cè)蛇床子素可能主要以代謝產(chǎn)

19、物形式排泄，在體內(nèi)被廣泛代謝。蛇床子素+甘草酸配伍組中24h內(nèi)蛇床子素尿液累積排泄量占給藥量的0.08％，糞便累積排泄量占給藥量的0.96％。雖然甘草酸使蛇床子素尿液中排泄增多，但由于蛇床子素在體內(nèi)經(jīng)尿和糞便排泄不到1％，所以甘草酸對(duì)其排泄的影響幾乎可以忽略不計(jì)。
　　最后采用大鼠藥代動(dòng)力學(xué)模型，研究了甘草酸體內(nèi)水解產(chǎn)物甘草次酸對(duì)蛇床子素體內(nèi)生物利用度的影響，結(jié)果表明甘草次酸不能顯著提高蛇床子素的體內(nèi)生物利用度，揭示甘草酸顯著提高

20、蛇床子素生物利用度主要通過(guò)甘草酸本身，而非通過(guò)其體內(nèi)水解產(chǎn)物甘草次酸發(fā)揮作用，與機(jī)制探討結(jié)果相吻合。該結(jié)果從體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證了甘草酸提高蛇床子素體內(nèi)生物利用度作用主要通過(guò)甘草酸提高了蛇床子素的溶解度，從而提高其體內(nèi)生物利用度。
　　本課題采用熱熔擠出技術(shù)，通過(guò)輔料篩選，制備蛇床子素固體分散體，從而增加蛇床子素的溶解度，大鼠藥代動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)該固體分散體可以提高蛇床子素生物利用度。采用甘草酸配伍改善蛇床子素的溶解度，提高其生物利用度，并從