拷貝數(shù)高頻變異基因PPP1R16A在肝癌發(fā)展中的作用研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（以下簡稱肝癌）(Hepatocellular carcinoma，HCC)具有起病隱匿、發(fā)展進(jìn)程快和病人預(yù)后差的特點。肝癌在發(fā)病早期癥狀并不明顯，并且由于肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng)，故通常在確診肝癌時，患者已經(jīng)處于癌癥的中晚期，失去了最佳的治療時機(jī)，從而致使肝癌的發(fā)病率和死亡率居高不下。肝癌的發(fā)病是一個多層次的復(fù)雜生物過程，涉及了多條信號通路和多個基因的改變。從遺傳學(xué)角度來看，肝癌的發(fā)病是既涉及個體的遺傳背景，環(huán)境因

2、素也在其中發(fā)揮了重要的作用。在我國，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的感染是造成肝癌高發(fā)的主要危險因素。HBV病毒DNA會整合進(jìn)入宿主的基因組中，并通過單個基因的點突變、基因組大片段的拷貝數(shù)變異、染色體易位等多種突變形式，引起重要信號通路上重要基因功能的改變?？截悢?shù)變異(Copy number variations，CNVs)是基因組在結(jié)構(gòu)上發(fā)生變異的一種重要形式，包含染色體基因組上大片段(≥1kb)的擴(kuò)增、缺

3、失和插入以及多種形式組合的復(fù)雜變異，相比于單個基因的點突變(point mutation)，拷貝數(shù)變異具有更高的突變率。已有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌染色體中存在HBV整合的熱點區(qū)域，并且這些區(qū)域與肝癌中發(fā)生拷貝數(shù)高頻變異的片段存在顯著的相關(guān)性。以上結(jié)果提示，HBV引起的拷貝數(shù)高頻變異可能在肝癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。因此，從拷貝數(shù)變異角度入手對肝癌進(jìn)行研究，將有助于深化對HBV相關(guān)肝癌的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為相關(guān)肝癌的診斷和治療提供新的思路和手

4、段。
　　本課題通過分析表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，尋找在肝癌與配對癌旁組織中存在差異表達(dá)的基因集，并將其與文獻(xiàn)檢索獲得的肝癌中發(fā)生拷貝數(shù)高頻變異片段進(jìn)行整合分析，從中篩選在肝癌中存在異常表達(dá)且發(fā)生拷貝數(shù)高頻變異的重要基因。運用分子生物學(xué)實驗技術(shù)在大樣本量的肝癌與配對癌旁組織中，驗證并比較該基因在基因組水平與轉(zhuǎn)錄水平的差異，以及兩者的相關(guān)性。再通過臨床樣本驗證和生物信息學(xué)分析，觀察在肝癌發(fā)展各個過程中，該基因在兩個水平中的變化趨勢。進(jìn)一步在體

5、外通過siRNA靶向沉默技術(shù)，觀察抑制該基因的表達(dá)后對肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力和細(xì)胞周期等生物學(xué)行為的影響，以明確該基因在肝癌發(fā)展中的作用。最后，通過對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和驗證，對該基因發(fā)揮具體作用的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。
　　通過對文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，首先我們明確了在肝癌的染色體上存在多個拷貝數(shù)高頻變異（擴(kuò)增或缺失）片段。通過分析本課題組前期完成的HBV相關(guān)肝癌的表達(dá)譜芯片，我們得到了差異表達(dá)的基因集，與拷貝數(shù)高頻變異片段進(jìn)行整合分析后

6、，我們發(fā)現(xiàn)位于拷貝數(shù)高頻擴(kuò)增片段8號染色體2區(qū)4帶3亞帶(8q24.3)的上的蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基16A(Protein phosphatase1 regulatory subunit16A，PPP1R16A)在肝癌組織中存在顯著的上調(diào)表達(dá)。通過對收集的肝癌與配對癌旁組織樣本并進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，我們證實相較于癌旁組織，肝癌組織中PPP1R16A存在基因組水平和轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)，并且兩者具有一定的相關(guān)性。這一結(jié)果表明，肝癌中P

7、PP1R16A存在拷貝數(shù)的擴(kuò)增，并且其轉(zhuǎn)錄增加。對從正常肝進(jìn)展到肝癌各階段該基因的拷貝數(shù)變異和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)PPP1R16A基因組和轉(zhuǎn)錄水平隨肝癌進(jìn)程而逐漸增加。在體外通過構(gòu)建siRNA靶向沉默PPP1R16A的肝癌細(xì)胞系HCCLM3，并觀察細(xì)胞增殖、克隆形成能力和細(xì)胞周期等生物學(xué)行為的變化，我們發(fā)現(xiàn)靶向沉默PPP1R16A可以顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期循環(huán)，提示該基因在肝癌中可能發(fā)揮促癌的作用。通過對在表達(dá)譜芯片中

8、，與PPP1R16A表達(dá)具有很高相關(guān)性的基因集進(jìn)行KEGG pathway分析，我們證實這些mRNAs在細(xì)胞周期相關(guān)信號通路中有明顯的富集。在干擾PPP1R16A后，對肝癌細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，證實CDK2、CDK4、SKP2等基因的表達(dá)明顯下調(diào)，提示PPP1R16A可能通過調(diào)控周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響了肝癌細(xì)胞的增殖和周期。本研究通過探討了拷貝數(shù)高頻變異片段上重要基因的作用，豐富了對于拷貝數(shù)變異在肝癌發(fā)病過程機(jī)制的