高通量芯片篩選肝細胞肝癌拷貝數變異及相關基因的研究.pdf

1、第一部分、高通量單核苷酸芯片篩選肝細胞肝癌拷貝數變異及相關基因
　　 目的：探討全基因組拷貝數變異(Copy number variation，CNV)在肝細胞肝癌(Hepatocellular carcmoma，HCC)患者中的變化情況以及與HCC的關系。
　　 方法：1、用Affymetrix500K SNP(Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)芯片檢測50例試驗組(乙型病毒

2、性肝炎(Heptesis B virsus，HBV)陽性HCC患者)和50例對照組(乙型病毒性肝炎陽性無HCC對照人群)中的CNV；2、在檢測出的HCC可能相關的CNV中，隨機挑選5個CNV，用實時定量PCR(SYBRGreen real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)在282例試驗組(乙型病毒性肝炎陽性HCC患者)和278例對照組(乙型病毒性肝炎陽性無HCC對照人群)中驗證芯片篩選結果。<

3、br>　　 結果：1、檢測到HCC可能相關的拷貝數變異區(qū)域(CNV regions)共有13個，其中10個為拷貝數擴增，3個為拷貝數缺失。2、經與DGVs數據庫和UCSC數據庫比對，13個拷貝數變異區(qū)域中，6個與DGVs數據庫報道的存在于正常人群的CNV區(qū)域重疊；2個與UCSC數據庫報道的在一些遺傳病中出現的CNV區(qū)域一致；1個共存于DGVs數據庫和UCSC數據庫中；4個為新發(fā)現的CNV區(qū)域(2q14.3，6q16.1，8q23.2，

4、17q22的擴增)。3、發(fā)生率較高的為2個擴增區(qū)域：2號染色體2p12(64％)和5號染色體5q34(60％)，以及一個缺失區(qū)域：15號染色體15q23(62％)。4、隨機挑選5個CNV區(qū)域(2q14.3，5q34，8q23.2，7q11.23，17q25.3)，經實時定量PCR檢測證實與芯片結果一致。5、共檢測到CNV相關的HCC可能相關基因有14個，其中5個基因首次在肝細胞肝癌中報道。
　　 結論：肝細胞肝癌患者中存在CNV

5、，且可能與HCC的發(fā)生有重要關系，并有可能成為遺傳易感標志，同時有助于尋找HCC的相關基因。
　　 第二部分、肝細胞肝癌可能相關基因相互關系及功能分類的網絡構建
　　 目的：探討肝細胞肝癌可能相關基因的相互關系及功能分類。
　　 方法：用GO、MAS3.0、DAVID和STRING服務器在線分析檢測到的14個CNV相關的HCC可能相關基因，挖掘這些基因可能參與的信號通路，相互作用方式，功能分類與蛋白網絡，預測其在

6、肝細胞肝癌中可能的作用方式和通路。
　　 結果：14個CNV相關的HCC可能相關基因主要涉及蛋白磷酸化，質膜構成，序列變異，可變剪接，轉錄，剪接變異，質膜，胞外區(qū)，誘變位點，疾病基因突變，胞膜構成，有轉錄本調節(jié)活性，二硫鍵，信號，信號肽，多態(tài)性，剪接變異體，糖蛋白。STRING分析發(fā)現這14個CNV相關的HCC可能相關基因網絡中有兩個重要節(jié)點：GABRG2和KIF2B，且均和癌癥有關。
　　 結論：14個CNV相關的HC

7、C可能相關基因在HCC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。
　　 第三部分、NOVA1基因和拷貝數變異區(qū)域14q12以及肝細胞肝癌關系的研究
　　 目的：探討拷貝數變異區(qū)域14q12與相關基因NOVA1(Neuro-oncological ventralantigen1，腫瘤神經腹側抗原)之間的關系，以及兩者與HCC之間的相互關系。
　　 方法：1、實時定量PCR4(SYBR Green real-time PCR，R

8、T-PCR)檢測282例試驗組(HBV陽性HCC患者)和278例對照組(HBV陽性無HCC對照人群)外周血中14q12拷貝數變異，擴大樣本以驗證14q12拷貝數變異與HCC的關系；2、免疫組化檢測120例乙肝陽性HCC患者的肝癌組織、癌旁組織中14q12拷貝數變異區(qū)域相關基因NOVA1的蛋白表達水平，以了解NOVA1基因與HCC的關系。3、取40例HBV陽性HCC患者的肝癌組織，免疫組化檢測NOVA1蛋白的表達，同時RT-PCR檢測14

9、q12的拷貝數變異情況，以了解NOVA1基因與14q12的拷貝數變異之間的關系。
　　 結果：1、RT-PCR結果示14q12拷貝數變異區(qū)域在282例試驗組中拷貝數增高，與對照組相比差異具有統計學意義。2、免疫組化結果示NOVA1蛋白在肝細胞肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織，差異具有統計學意義。3、在40例HBV陽性HCC患者的肝癌組織中同時檢測14q12拷貝數變異及NOVA1蛋白表達，結果顯示14q12拷貝數擴增的患者其肝癌組織

10、中NOVA1蛋白亦呈高表達，差異具有統計學意義。
　　 結論：1、14q12拷貝數擴增是HCC相關的拷貝數變異區(qū)域；2、NOVA1基因為14q12拷貝數變異區(qū)域的相關基因；3、NOVA1基因是肝細胞肝癌相關基因，在肝細胞肝癌的發(fā)生中可能起重要作用。
　　 第四部分、NOVA1基因過表達對肝癌細胞生長增殖的影響
　　 目的：檢測NOVA1基因過表達對肝癌細胞生物學行為的影響。
　　 方法：1、使用逆轉錄PC

11、R(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT=PCR)法檢測(SMMC-7721，HepG2，MHCC97H，MHCC97L，SK-HepG1，PLC/PRF/5)6株肝細胞肝癌細胞株及1株正常肝細胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表達，以篩選出低表達NOVA1的細胞株；2、構建NOVA1基因過表達質粒，并轉染低表達NOVA1基因的細胞株；3、MTT法檢測經轉染后肝癌細胞

12、的生長曲線；4、流式細胞儀檢測經轉染后肝癌細胞的細胞凋亡。
　　 結果：1、SMMC-7721細胞株和MHCC97L細胞株為低表達NOVA1基因的肝癌細胞株；2、MTT法檢測結果顯示轉染了過表達NOVA1基因質粒的SMMC-7721細胞和MHCC97L細胞與未轉染的SMMC-7721細胞和MHCC97L細胞比較，生長增殖能力明顯增強：3、流式細胞儀檢測結果顯示轉染了過表達NOVA1基因質粒的SMMC-7721細胞和MHCC97L

13、細胞的早期凋亡和晚期凋亡均明顯減弱。
　　 結論：NOVA1基因可促進肝癌細胞的生長增殖、抑制凋亡，是肝細胞肝癌相關基因，對肝細胞肝癌的發(fā)生可能有重要意義。
　　 第五部分、NOVA1基因干擾對肝癌細胞生長增殖的影響
　　 目的：檢測NOVA1基因干擾對肝癌細胞生物學行為的影響。
　　 方法：1、使用逆轉錄PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reactio

14、n，RT-PCR)法檢測(SMMC-7721，HepG2，MHCC97H，MHCC97L，SK-HepG1，PLC/PRF/5)6株肝細胞肝癌細胞株及1株正常肝細胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表達，以篩選出高表達NOVA1的肝癌細胞株；2、構建NOVA1基因干擾質粒，并轉染高表達NOVA1基因的HepG2細胞株和MHCC97H細胞株；3、MTT法檢測經轉染后肝癌細胞的生長增殖；4、流式細胞儀檢測經轉染后肝癌細胞的細胞凋亡；5、

15、劃痕實驗檢測經轉染后肝癌細胞的細胞遷移能力。
　　 結果：1、HepG2細胞株和MHCC97H細胞株為高表達NOVA1的肝癌細胞株；2、MTT法檢測結果顯示轉染了NOVA1基因干擾質粒的HepG2細胞和MHCC97H細胞生長增殖能力明顯減弱；2、流式細胞儀檢測結果顯示轉染了NOVA1基因干擾質粒的肝癌細胞的凋亡更為明顯。3、細胞劃痕實驗結果顯示轉染了NOVA1基因干擾質粒的肝癌細胞遷移能力明顯減弱。
　　 結論：NOVA