LOX在百草枯致肺纖維化過程中上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、百草枯（Paraquat，PQ）中毒是發(fā)展中國家急性中毒患者死亡的主要原因。肺是其主要靶器官，PQ中毒后，迅速在肺內(nèi)積聚，導致肺泡上皮細胞滲透性增加，肺出血、水腫，引起急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合癥，進一步發(fā)展為肺纖維化，肺纖維化是 PQ中毒導致死亡的主要原因。PQ中毒沒有特殊解毒藥物，因此研究百草枯導致的肺纖維化的機制具有重要意義。
　　肺纖維化的主要病理特征是肺泡結(jié)構(gòu)破壞，功能喪失，成纖維細胞和肌成纖維細胞增殖及細胞外基質(zhì)沉積

2、(extracellular matrix，ECM)。在肺纖維化的過程中，分泌細胞外基質(zhì)的主要是肌成纖維細胞。肌成纖維細胞主要有3個來源，間質(zhì)內(nèi)的成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞；骨髓干細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞；肺泡上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）。研究表明EMT是肺纖維化中肌成纖維細胞的重要來源，目前大量的實驗關(guān)注EMT在纖維化疾病中的研究。在ECM的沉積中起重要作用的是

3、賴氨酰氧化酶（Lysyl oxidase，LOX），LOX是一種銅依賴性氨基酸氧化酶，通過催化細胞外的膠原蛋白和彈性蛋白特定位置的賴氨酰殘基氧化脫氨，引起分子內(nèi)和分子間的共價交聯(lián)，從而形成穩(wěn)定的不溶性的ECM，在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。另外，大量的研究越來越重視LOX在細胞內(nèi)的功能并提出LOX可能在EMT過程中發(fā)揮作用。我們之前的研究表明EMT在PQ誘導的肺纖維化中發(fā)揮重要作用，因此我們推斷LOX是否在PQ導致的肺纖維化的EM T中發(fā)揮

4、作用。論文主要探討LO X在PQ中毒后導致的肺纖維化過程中與EMT的關(guān)系。本課題進行了以下研究：
　　1．觀察百草枯中毒后LOX表達、肺纖維化及EMT的情況
　　(1)制備PQ中毒大鼠模型，蘇木素-伊紅(HE)和M asso n染色評估肺組織病理學改變；免疫組化和Western Blot檢測肺組織中LOX蛋白表達；Western Blot檢測肺組織中EMT上皮標志蛋白 ZO-1、E-cadherin和間質(zhì)標志α-SMA、Vi

5、mentin蛋白表達。
　　(2)制備PQ中毒體外模型，采用不同濃度的PQ處理RLE-6TN和A549細胞24 h，觀察細胞形態(tài)變化；采用Western Blot檢測細胞上皮和間質(zhì)蛋白表達變化。
　　2. LOX在百草枯致肺纖維化過程中EMT的作用
　　(1)制備PQ中毒大鼠模型，采用LOX抑制劑BAPN腹腔內(nèi)注射處理動物后PQ染毒；蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色評估肺組織病理學改變；免疫組化和Western

6、Blot檢測肺組織中LOX蛋白表達；Western Blot檢測肺組織中上皮標志物、間質(zhì)標志物的表達。
　　(2)制備PQ中毒體外模型，采用LOX抑制劑BAPN處理細胞后再PQ染毒；觀察細胞形態(tài)；Western Blot檢測細胞中LOX、上皮標志物和間質(zhì)標志物的表達。
　　(3)制備PQ中毒體外模型，體外采用LOX基因沉默（siRNA）沉默LOX基因再進行PQ處理；觀察細胞形態(tài)的變化；Western Blot檢測細胞中LOX

7、表達；Western Blot和免疫熒光檢測細胞中上皮標志物和間質(zhì)標志物的表達。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1. HE和Masson染色顯示PQ染毒72 h后大鼠肺內(nèi)大量炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積；免疫組化和Western Blot結(jié)果顯示大鼠染毒72 h后肺組織內(nèi)LOX增高；EMT上皮標志蛋白ZO-1和E-cadherin在大鼠中毒72 h后表達減少，間質(zhì)標志α-SMA和Vimentin蛋白表達增強。這一結(jié)果提示PQ中毒

8、后大鼠肺纖維化早期即發(fā)生，并伴隨LOX表達升高及EMT的發(fā)生。
　　2.獲得PQ誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的體外模型，PQ對細胞存活率的影響具有濃度依賴性，RLE-6 TN細胞在PQ濃度為80μmo l/L時存活率為47.88％，A549細胞在PQ濃度800umo l/L時生存率為54.96%，我們以此濃度建立RLE-6TN和A549細胞PQ中毒的模型。
　　3. PQ處理A549和RLE-6TN細胞24 h后，細胞由圓形或卵圓形變成

9、長梭形，LOX蛋白表達增加，EMT的上皮標志E-cadherin和ZO-1表達降低，間質(zhì)標志α-SMA和Vimentin表達升高，細胞發(fā)生了EMT。
　　5.應(yīng)用LOX的抑制劑BAPN抑制RLE-6TN和A549細胞LOX蛋白活性，再進行PQ處理，EMT的程度減弱；且減弱程度隨抑制劑的濃度增加而增強。
　　6. siRNA沉默A549細胞LOX基因后，再進行PQ處理24 h，發(fā)現(xiàn)A549細胞EMT的程度被減弱。
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10、.單純用抑制劑BAPN處理RLE-6TN和A549細胞和大鼠肺組織后，細胞形態(tài)沒有發(fā)生變化，但EMT標志蛋白ZO-1和E-cadherin升高，間質(zhì)標志α-SMA和Vimentin水平降低，類似于細胞發(fā)生了“間質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）”
　　基于以上結(jié)果我們推測，在PQ誘導的肺纖維化過程中，LOX的表達可以促進EMT的進展，抑制LOX的活性，EMT的程度被減