上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)在百草枯中毒大鼠肺纖維化中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)一種在世界范圍內(nèi)廣泛使用的高效除草劑。近20年來，隨著其在我國國內(nèi)的普及使用，PQ中毒的發(fā)病率急劇上升，2001～2010年全國文獻(xiàn)報(bào)道的總例數(shù)是過去10年的15倍。由于PQ致死劑量極低(人經(jīng)口致死量30～40mg/kg)，又缺乏特效的解毒劑治療，臨床死亡率卻一直居高不下，國內(nèi)外報(bào)道高達(dá)60％～87.8%。PQ中毒一直是近年急診醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點(diǎn)之一，并已逐步上升為一個(gè)嚴(yán)峻的社會(huì)問題。
　　

2、肺是PQ中毒的主要靶器官，由于肺泡Ⅰ，Ⅱ型細(xì)胞和細(xì)支氣管細(xì)胞膜上多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的大量表達(dá)，肺組織PQ的濃度要比血漿濃度高6～10倍，而PQ對(duì)肺泡細(xì)胞的氧化損傷和隨后出現(xiàn)的肺纖維化導(dǎo)致的快速進(jìn)展的呼吸衰竭是PQ中毒導(dǎo)致患者死亡的主要原因。快速進(jìn)展的彌漫性肺纖維化，是PQ中毒的特征性病理改變。但是，目前關(guān)于PQ中毒肺纖維化的起源、形成機(jī)制仍不清楚，國內(nèi)外相關(guān)的基礎(chǔ)研究，十分匱乏。
　　 肺纖維化特征性的病理生理過程是肌成纖維細(xì)胞(MF

3、b)的活化與增生，大量的肌纖維母細(xì)胞堆積并過分產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)是肺纖維化病理過程形成和發(fā)展的原因。但是關(guān)于MFb的起源和形成過程，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)正在受到越來越多的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，MFb來源于肺內(nèi)固有的間充質(zhì)細(xì)胞，而近年的研究認(rèn)為，MFb除來源于肺內(nèi)固有的間充質(zhì)細(xì)胞外，還可能來源于外周血(骨髓源性)。新近，支氣管、肺泡上皮細(xì)胞可能通過“上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)”而成為MF

4、b的部分來源的觀點(diǎn)，正得到越來越多的研究證明而備受關(guān)注。EMT是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，并獲得轉(zhuǎn)移能力的過程，很久以來一直被認(rèn)為在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中起主導(dǎo)作用。近10年的研究證實(shí)，EMT與纖維化的發(fā)生發(fā)展也有著密切的聯(lián)系，EMT在腎間質(zhì)、心肌、肝臟等臟器的纖維化中，起著十分重要，甚至是關(guān)鍵性的作用。EMT在肺纖維化中的作用，也正日益被證實(shí)：體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可以通過EMT而成為MFb的部分來源

5、；博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)了肺泡、支氣管上皮細(xì)胞能通過EMT向MFb轉(zhuǎn)變；特發(fā)性肺纖維化患者的活檢標(biāo)本中，也觀察到EMT參與了肺纖維化的形成。
　　 那么，PQ中毒作為近20年才出現(xiàn)的一種新的疾病，作為肺纖維化疾病中的一個(gè)特殊病種，其肺纖維化的形成是否也有EMT參與呢？如果有，在分子水平上，參與EMT調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑又有哪些？
　　 EMT時(shí)，會(huì)發(fā)生下列特征性的變化：上皮細(xì)胞失去其上皮表型，上皮細(xì)胞

6、標(biāo)志物“上皮細(xì)胞鈣粘素(E-Cadherin，E-Cad)”表達(dá)丟失，并獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)?；诖藱C(jī)理，我們設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)研究。
　　 首先，采用一次性腹腔注射PQ的方法，制作PQ中毒大鼠模型。然后，收集染毒后不同時(shí)間點(diǎn)中毒大鼠的肺組織，用苦味酸天狼星紅染色(picrosiriusredstaining)觀察肺纖維化的動(dòng)態(tài)變化；用免疫組化、R

7、ealtimeRT-PCR、Westernblot等方法，觀察上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物基因和蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，探討PQ中毒大鼠肺纖維化模型中肺上皮細(xì)胞是否通過EMT參與了肺纖維化的形成過程。最后，對(duì)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探索，觀察TGF-β1/Smads、Wnt/β-catenin兩條分子內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)的可能作用。
　　 目的：
　　 探討肺組織上皮細(xì)胞是否通過“上皮-

8、間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)”參與了PQ中毒大鼠的肺纖維化形成過程，并初步探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法：
　　 第一章PQ中毒大鼠的模型建立。用一次性腹腔注射PQ(15mg/Kg)的方法，建立PQ中毒大鼠模型。72只大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(中毒組，n=48)和對(duì)照組(n=24)，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射20%PQ(劑量15mg/Kg)，對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水，分別于染毒后第1、3、7、10、14、21d處死大鼠，實(shí)驗(yàn)組每次

9、8只，對(duì)照組每次4只，留取肺組織標(biāo)本。兩組標(biāo)本行蘇木精-伊紅(H-E)染色，光鏡下觀察肺組織病理變化；行苦味酸天狼星紅(Picrosiriusred)膠原特異染色，觀察肺組織纖維化程度變化，計(jì)算膠原容積積分(collagenvolumefraction，CVF)。
　　 第二章EMT在PQ中毒大鼠肺纖維化中的作用。用免疫組化(EnVision兩步法)、RealtimeRT-PCR、Westernblot方法，觀察：(1)上皮細(xì)胞

10、標(biāo)志物E-Cad的基因和蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。(2)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin和成纖維細(xì)胞特異蛋白(FSP-1)的基因和/或蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。(3)Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ，Col-Ⅰ)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenⅢ，Col-Ⅲ)的基因和/或蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。(4)轉(zhuǎn)錄因子Slug(Snai12)和Twist的基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。
　　 第三章TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在PQ中毒肺纖維化E

11、MT中的作用。用RealtimeRT-PCR方法，檢測染毒后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad7mRNA的動(dòng)態(tài)變化。
　　 第四章Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在PQ中毒肺纖維化EMT中的作用。用RealtimeRT-PCR方法，檢測染毒后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織TGF-β1、Wnt2和β-cateninmRNA的動(dòng)態(tài)變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一章急性肺泡炎是PQ染毒后第1w的主要病理

12、表現(xiàn)，第14d見肺泡間隔內(nèi)大量膠原纖維沉積，第21d有所減輕。在實(shí)驗(yàn)組，各不同時(shí)間點(diǎn)肺組織CVF變化，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組，CVF從染毒后第3d開始升高，第14d達(dá)高峰，第21d有所回落，與同期對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01))。模型建立成功。
　　 第二章在實(shí)驗(yàn)組，各不同時(shí)間點(diǎn)肺組織E-Cad、α-SMA、Vimentin、FSP-1、C

13、ol-Ⅰ、Col-Ⅲ、Slug和Twist的基因和/或蛋白表達(dá)變化，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組，PQ染毒后第3d，E-Cad表達(dá)開始逐漸下調(diào)，第14d降至谷底，第21d有所回升；PQ染毒后第3～7d，α-SMA、Vimentin、FSP-1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Slug、Twist的基因(和蛋白)表達(dá)開始逐漸上調(diào)，第14d達(dá)峰值，第21d有所回落。
　　 第三章在實(shí)

14、驗(yàn)組，各不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TGF-β1和Smad2的基因表達(dá)變化，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)組，PQ染毒后第7d，TGF-β1mRNA表達(dá)開始逐漸上調(diào)，第10d，Smad2mRNA表達(dá)開始逐漸上調(diào)，兩者均在第14d達(dá)峰值，第21d有所回落。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，不同時(shí)間點(diǎn)的Smad7mRNA表達(dá)均無明顯變化。
　　 第四章在實(shí)驗(yàn)組，各不同時(shí)間點(diǎn)肺組織Wnt2和β-cateni

15、nmRNA表達(dá)變化，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)組，PQ染毒后第10d，Wnt2和β-cateninmRNA表達(dá)突然大幅度上調(diào)，第21d達(dá)峰值，觀察期內(nèi)未見回落。
　　 結(jié)論和展望：
　　 PQ中毒肺纖維化模型大鼠肺組織上皮細(xì)胞發(fā)生了較為典型的EMT現(xiàn)象，肺泡上皮細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞，可能是MFb的一個(gè)重要來源，在PQ中毒肺纖維化進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。TG

16、F-β1是PQ中毒肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中重要的細(xì)胞因子，其持續(xù)高表達(dá)可能通過Smad2依賴的TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和非Smad依賴的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT。
　　 PQ中毒肺組織EMT現(xiàn)象的新發(fā)現(xiàn)，是PQ中毒肺纖維化形成機(jī)制的重要突破，將為PQ中毒的臨床治療帶來新思路、新策略、新前景，為PQ中毒特效解毒劑的尋找、靶基因治療、新藥物的開發(fā)等提供重要的理論依據(jù)。但PQ中毒肺上皮