百草枯誘導肺纖維化大鼠中Hedgehog信號通路的作用、藥物干預研究及自噬現(xiàn)象.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 Hegdghog信號通路在百草枯肺纖維化大鼠模型中的表達情況
　　目的:百草枯中毒主要引起以肺損傷為主的多系統(tǒng)功能損害，以肺纖維化最常見，死亡率極高，但其肺損傷及肺纖維化的具體機制未完全明確。
　　方法:不同劑量的百草枯原液(體積分數(shù)20％，劑量10、50、100mg/kg)分別灌胃6-8周Wister雄性大鼠，以造?？诜俨菘葜卸局路卫w維化，試驗隨機分組，分為正常對照組(n=

2、30)，百草枯染毒組(n=90，劑量10、50、100mg/kg，n=30×3)，觀察染毒大鼠第1、3、7、14、21、28天六個時間段的一般情況（精神、攝食、毛色、活動、體重等），從而確定百草枯誘導肺纖維化的造模用藥劑量（該用藥劑量稱為染毒組，PQ組）。蒸餾水灌胃正常對照組，將染毒組(PQ，n=30)和正常對照組(Cont，n=30)，于第1、3、7、14、21、28天六個時間段分別處死各組大鼠，并收集大鼠血清標本監(jiān)測兩組大鼠超氧化物

3、歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)的血清學指標。
　　結(jié)果:1.Cont組大鼠平均體重隨著喂養(yǎng)時間的延長穩(wěn)步增加，PQ組大鼠染毒后體重早期（3-7天）增加極慢，3天、7天及14天時與Cont組比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，染毒21天時體重明顯增加，21天、28天，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.20％百草枯原液配比劑量50mg/kg灌胃大鼠可模擬口服百草枯中毒的肺纖維化過程，大致

4、經(jīng)過肺泡充血水腫、急性肺泡炎、肺纖維化，確定該濃度為造模濃度。
　　3.PQ組Hyp含量（單位:μmol/L）隨時間推移有所升高。
　　4.HE染色顯示Cont組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，PQ組大鼠肺組織按時間順序呈現(xiàn)由肺泡炎至纖維化的動態(tài)改變:早期（1-7天）表現(xiàn)為嚴重的肺泡炎性滲出，大量的炎性細胞浸潤，與Cont組比，肺泡炎評分差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Masson結(jié)果示Cont組結(jié)構(gòu)正常;PQ組（3-7天）早期少量膠

5、原纖維分布，中后期（14-21天）可見支氣管管壁與肺泡間隔呈纖維性增厚，大量不規(guī)則排列膠原纖維，與Cont組比，肺纖維化評分差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.免疫熒光及組化顯示PQ組肺組織ERK、TGF-β1、Smad3、Gli1的表達均明顯增高;RT-PCR和Western-blot顯示，PQ組肺組織的Gli1、Shh、ERK、TGF-β1、Smad3等蛋白的表達均高于Cont組，且PQ組肺組織中的Gli1、Shh在2

6、1天達高峰，TGF-β1、Smad3、ERK在14天達高峰，與Cont組比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.20％百草枯原液配比劑量50mg/kg灌胃Wister雄性大鼠可以成功模擬口服百草枯致肺纖維化的過程，肺部病變主要表現(xiàn)為早期的肺泡炎和晚期的纖維化。
　　2.Hh信號通路在正常大鼠肺組織中處于抑制狀態(tài)，百草枯染毒后被異常激活，且隨著肺纖維化的進展，Hh信號通路的活化程度增加，因此Hh信號通路的異常激活

7、可能與百草枯肺纖維化有一定的聯(lián)系。
　　關鍵詞:百草枯;肺纖維化;Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路
　　第二部分 環(huán)巴胺及Gant61在百草枯誘導肺纖維化大鼠中的治療作用
　　目的:本試驗以Hedgehog信號通路為切入點，以Hedgehog信號通路的關鍵環(huán)節(jié)為研究靶點，探討Cyclopamine及Gant61是否有減輕百草枯誘導的大鼠肺纖維化程度，并明確其機制是否與抑制Hh信號通路而實現(xiàn)，同時探索Hh信號通路與TGF-β

8、1介導的ERK及Smad信號通路之間的聯(lián)系。
　　方法:6-8周Wister雄性大鼠隨機分為正常對照組(Cont，n=30)、百草枯染毒組(PQ，n=30)、Cyclopamine干預組(Cyc，n=30)、Gant61干預組(Gant，n=30)、SB431542干預組(SB，n=30)。50mg/kg百草枯灌胃Cyc、Gant、SB各干預組，分別給予Cyclopamine(5mg/kg/d)、Gant61(200μg/kg/d

9、)和SB431542(100μg/kg/d)腹腔注射，于第1、3、7、14、21、28天分別處死5只大鼠，收集各組大鼠血清以檢測各組大鼠的SOD、MDA、GSH血清學指標;測定肺組織羥脯氨酸(Hyp)水平;HE染色和Masson染色評分，評估不同時間段各組大鼠肺泡炎及纖維化病變的程度;免疫組化、免疫熒光、RT-PCR和Western-blot等技術(shù)分析大鼠肺組織Hh通路中轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Shh和其他信號因子TGF-β1、ERK、Sma

10、d3等的表達。
　　結(jié)果:1.Cont組、PQ組及各干預組大鼠初始平均體重無差異，PQ染毒后早期(3-7天)大鼠體重增長極慢，各干預組體重增加緩慢，第7天各干預組大鼠體重較PQ組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各干預組21天時體重與Cont組及PQ組差距減小，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.各干預組的MDA在早期升高不明顯，上升程較PQ組度低，1天時SB組及Cyc組，3天時Cyc組及Gant組，與PQ組比差別有一定

11、的統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各干預組的SOD、GSH含量在染毒早期明顯下降，第3天、7天二者含量與PQ組比，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，下降持續(xù)時間也比PQ組短，在染毒后期(21天-28天)各指標與Cont組比無明顯差別(P＞0.05)。
　　3.各干預組大鼠肺組織中Hyp呈類似于PQ組的變化趨勢，給予藥物干預后大鼠肺組織Hyp水平升高時間延后。3天時，各干預組與Cont組Hyp的濃度的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);

12、7天、14天、28天，Hyp含量差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各干預組肺組織Hyp水平均不同程度降低，與PQ組比，Hyp含量3天、7天差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);14天、28天差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.各干預組病理HE及Masson染色改變類似于PQ組的變化規(guī)律，呈現(xiàn)由肺泡炎到肺纖維化的動態(tài)改變，但炎癥和纖維化評分較PQ組輕;與PQ組比，各干預組肺泡炎及肺纖維化均有不同程度改善，SB組3天、7天，Cyc

13、組1天、3天、7天，Gant組在3天、7天及14天時，肺泡炎評分較PQ組比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各干預組14天、21天及28天肺纖維化評分較PQ組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.免疫熒光、免疫組化、RT-PCR及Western-blot方法顯示Gli1、TGF-β1、ERK、Smad3、Shh在各干預組中的表達規(guī)律同PQ組，但是表達量有一定程度的下降。染毒7天時，各干預組Gli1的表達開始增高，21天達高峰，較PQ

14、組有所降低，在7天、14天、21天、28天相對Cont組和PQ組的表達倍數(shù)均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。染毒7天時，SB組、Cyc組、Gant組的TGF-β1、Smad3、ERK表達開始增高，14天達高峰，21天開始回降，各干預組表達較PQ組也有所降低。
　　結(jié)論:1.Cyclopamine和Gant61通過抑制Hh信號通路而延緩和改善百草枯肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展，SB431542可以抑制TGF-β1介導的ERK/Smad信號通路

15、而延緩和改善百草枯肺纖維化的進展。
　　2.PQ中毒后期Hyp含量升高，干預治療后升高的時間延后，程度減輕，提不Cyclopamine、Gant61、SB431542可以有效抑制肺組織中膠原纖維的增殖以及細胞外基質(zhì)的沉積，起到較好的抗肺纖維化作用。
　　3.Cyclopamine和Gant61調(diào)控的Hedgehog信號，與TGF-β1介導的ERK/Smad信號通路在百草枯肺纖維化發(fā)展過程可能存在一定的交互作用。PQ染毒后肺內(nèi)

16、Hedghog信號通路、TGF-β1信號通路被激活，而Cyclopamine、Gant61和SB431542抑制了PQ的這種作用。
　　第三部分 口服百草枯致肺損傷中的自噬現(xiàn)象
　　目的:自噬(autophagy)，細胞內(nèi)“自己吃自己”的現(xiàn)象，即self-eating，正常細胞極少發(fā)生自噬，自噬存在保守性和可誘導特性，自噬在百草枯誘發(fā)的肺損傷中所起作用是正面還是負面的尚未完全闡明，值得研究。
　　方法:Wister大鼠

17、分為正常對照組(Cont，n=30)、染毒組(PQ，n=30)，每組分6各亞組，每亞組5只大鼠，在1、3、7、14、21、28天通過透射電鏡分別觀察百草枯染毒后肺組織的的自噬現(xiàn)象，應用Western-blot監(jiān)測Beclin-1和LC3的表達。
　　結(jié)果:1.Cont組的肺組織超微結(jié)構(gòu)正常。與Cont組比，PQ組電鏡結(jié)果示:第7天自噬前體和初級溶酶體出現(xiàn);第14天自噬前體、自噬體均可見;第21天細胞中大量的自噬體、自噬溶酶體出現(xiàn);