甘蔗應答黑穗病菌侵染的降解組分析及抗性相關miRNA靶標挖掘.pdf

1、甘蔗黑穗病是一種由黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的真菌病害。培育和推廣抗黑穗病甘蔗品種是控制該病害的最有效方法。長期以來，人們從細胞學、形態(tài)學、生理生化抗性和分子互作機制等方面開展了諸多研究，證明甘蔗與黑穗病菌的互作是一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)。本研究立足于甘蔗對黑穗病菌侵染的應答反應的全方位和多角度研究，首先，通過研究黑穗病菌在蔗芽組織中的數(shù)量及活性氧代謝途徑和苯丙烷代謝途徑關鍵酶活性的變化，分析甘蔗與黑穗病菌互

2、作的時間點，以更準確地了解甘蔗有效應答黑穗病菌侵染的時間和強度，確定互作的關鍵時間點；其次，利用降解組測序技術鑒定受 miRNA剪切調(diào)控的靶標基因，分析靶標基因的降解位點，結(jié)合靶標基因的差異表達及功能分類，挖掘與抗病相關的靶標基因；最后，對所篩選的差異靶標基因及其對應的miRNA進行qRT-PCR表達分析，通過它們的表達趨勢和模式，進一步確定 miRNA的剪切調(diào)控作用，并分析靶標基因所涉及的代謝通路，以便進一步了解甘蔗應答黑穗病菌侵染的

3、響應機制，為基于分子生物學技術改良甘蔗品種的抗黑穗病性提供靶標基因及其相應的miRNA資源。主要研究結(jié)果如下：
　　1.以YC05-179（抗黑穗病甘蔗品種）和ROC22（感黑穗病甘蔗品種）為研究材料，接種黑穗病菌（處理組）和無菌水（對照組）0d、1d、2d、3d、5d、7d后，采用熒光定量PCR技術檢測蔗芽組織中黑穗病菌的菌量變化情況，并測定活性氧代謝途徑關鍵酶（POD、SOD和CAT）和苯丙烷代謝途徑關鍵酶（PPO、PAL和T

4、AL）的活性變化。結(jié)果表明，接種黑穗病菌后，無論是YC05-179或是ROC22，蔗芽組織中黑穗病菌的菌量都隨接種時間的延長而增加，且ROC22中的菌量多于YC05-179相應取樣時間點的菌量。此外，接種黑穗病菌后，YC05-179中POD、SOD和CAT的活性普遍比對照高，POD和CAT的活性也明顯高于ROC22的相應取樣時間點，且活性峰值較早出現(xiàn)，表明YC05-179中活性氧代謝途徑強度比ROC22相應時間點高，能夠更早應答黑穗病菌

5、的侵染。與此同時，接種黑穗病菌后，苯丙烷代謝途徑入口以TAL催化的通路為主，代謝途徑較弱，隨著接種時間的延長，PAL和 TAL共同發(fā)揮作用，使得苯丙烷代謝途徑增強，且YC05-179中由PAL催化的通路啟動較快。接種5 d時，蔗芽組織中活性氧代謝途徑和苯丙烷代謝途徑都較強，2d和3d次之，結(jié)合黑穗病菌的菌量在兩個品種接種2 d時即出現(xiàn)明顯差異，故認為接種2 d和5 d是研究甘蔗與黑穗病菌互作過程中靶標基因降解組測序的最佳時間點。

6、　　2.以YC05-179和ROC22的蔗芽組織為研究材料，以接種無菌水0 d的為對照，對接種黑穗病菌2 d和5 d的蔗芽進行降解組測序分析。6個樣品共得到122.33 M原始數(shù)據(jù)量，經(jīng)數(shù)據(jù)評估后，各樣品的Q30在93％以上，且用于下游降解位點分析的序列與甘蔗的參考序列完全匹配，表明降解組測序質(zhì)量較高。6個甘蔗樣品共檢測到309個靶mRNA，分別與97個已知miRNA和112個新miRNA相呼應，并鑒定了337處降解位點，表明miRNA

7、能夠有效剪切調(diào)控靶標基因的多個位點。靶標基因以Category0為主，涉及生命活動的多種調(diào)控過程，如信號轉(zhuǎn)導機制（Signal transduction mechanisms）、離子轉(zhuǎn)運機制（Inorganic ion transport and metabolism）、防御機制（Defense mechanisms）、翻譯及翻譯后修飾（Translation, posttranslational modification）、能量的產(chǎn)生

8、與轉(zhuǎn)導（Energy production and conversion）、甘油酯類代謝（Glycerolipid metabolism）等。GO分析表明，兩個甘蔗品種中差異表達的靶標基因的靶向分類基本一致，涉及到細胞（Cell）、膜（Membrane）、細胞器（Organelle）和細胞部分（Cell part）等細胞成分（Cellular component），主要發(fā)揮催化活性（Catalytic activity）和結(jié)合（Bind

9、ing）功能，可參與代謝過程（Metabolic process）、細胞生理過程（Cellular process）、單生物過程（Single-organism process）、應答刺激（Response to stimulus）、生物學調(diào)控（Biological regulation）、免疫系統(tǒng)過程（Immune system process）和信號途徑（Signaling）等。KEGG富集分析顯示，差異表達靶標基因參與植物激素信號

10、轉(zhuǎn)導途徑（Plant hormone signal transduction）、輔酶Q和其他萜醌類化合物生物合成（Ubiquinone and other terpenoid-quinonebiosynthesis）、泛素介導的蛋白降解途徑（Ubiquitin mediated proteolysis）、植物與病原菌互作途徑（Plant-pathogen interaction）、氧化磷酸化作用（Oxidative phosphoryl

11、ation）、過氧化物酶體途徑（Peroxisome）、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成途徑（Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis）、吞噬體（Phagosome）等與抗病性相關的代謝通路。
　　3.差異表達靶標基因及其對應miRNA的qRT-PCR表達分析。靶標基因和它們對應的miRNA至少在一個甘蔗品種中表達模式相反，這種表達模式正符合miRNA對靶標基因的剪切作

12、用。CCR參與木質(zhì)素生物合成途徑，在接種后表達量升高，有助于木質(zhì)素的合成與累積，有效應答黑穗病菌的侵染；UCH-L5與泛素介導的蛋白降解途徑密切相關，也可參與應答黑穗病菌的侵染；GK、MLO和 HIR1參與植物與病原菌的互作途徑，其中，GK具有NHO1活性，其表達量的升高可以增強甘蔗對黑穗病菌的抗性；此外，MLO還參與了鈣離子通路，與植物的抗病性表現(xiàn)出負相關；MLO基因的表達，在接種黑穗病菌后下降，減輕了MLO蛋白對防衛(wèi)反應的抑制作用；

13、HIR參與植物的過敏反應，接種黑穗病菌后，HIR1上調(diào)表達，蔗芽組織可以較早的發(fā)生過敏反應，以限制黑穗病菌的繼續(xù)擴展侵染；EIL3是乙烯信號途徑的轉(zhuǎn)錄因子，接種黑穗病菌后表達上調(diào)，使乙烯代謝途徑增強，有利于抵御黑穗病菌的侵染；ARF和AIP參與生長素信號途徑，接種黑穗病菌后，ARF8下調(diào)表達，且YC05-179中ARF8的下降幅度比ROC22小，而AIP上調(diào)表達，且表達量的上升幅度比ROC22大，表明生長素信號途徑可以應答黑穗病菌侵染；

14、此外，GRF8的下調(diào)表達，說明黑穗病菌的侵染在一定程度上抑制了甘蔗本身的生長；SAMDC參與多胺的生物合成，黑穗病菌侵染后，SAMDC的表達增強，表明黑穗病菌的侵染可以促使多胺代謝途徑增強；MYB是典型的抗病相關轉(zhuǎn)錄因子，MYB2在兩個品種中的表達趨勢不同，且在兩個品種中的應答時間不同，表明MYB2對黑穗病菌侵染的應答能力與甘蔗基因型的抗黑穗病性相關；AGO1B在兩個品種中表達模式相反，其中，YC05-179接種后表達下調(diào)，可以累積更多