轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的HT1080RIP1---細胞株和MDA-MB-231RIP1---細胞株構(gòu)建.pdf

1、目前常用的基因敲除/敲減技術(shù)包括針對mRNA操作的RNA干擾(RNAi)技術(shù)、和針對基因組操作的鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc-Finger Nucleases，ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN)和最近幾年發(fā)展起來的CRISPR/Cas9(Clustered Regμlarly InterspacedShort Palindro

2、mic Repeats RNA)技術(shù)等。其中TALEN技術(shù)具有特異性好、打靶效率高、操作便捷等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用在動植物真核細胞和胚胎基因組精確修飾領(lǐng)域。
　　具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸激酶活性的受體相互作用蛋白(receptor-interactingprotein1，RIP1)在調(diào)控細胞凋亡和細胞壞死性凋亡中占據(jù)重要地位。RIP1包含C末端磷酸激酶活性區(qū)(kinase domain，KD)、N末端死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，

3、DD)和中間區(qū)域(intermediate domain，ID)。ID區(qū)域含有RIP同型相互作用域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)。RIP1與RIP3通過RHIM域間相互作用結(jié)合形成復(fù)合體啟動細胞壞死性凋亡過程。作為一個重要的銜接蛋白，RIP1通過DD區(qū)域的同型相互作用(homotypic interaction)與多種細胞表面受體（如TLR3、TLR4、TNFR1和Fas等）組裝成細胞死亡信

4、號復(fù)合體。此外，RIP1磷酸激酶活性被抑制時細胞壞死性凋亡也被抑制，顯示RIP1磷酸激酶活性對細胞壞死性凋亡的重要性，但其分子機制尚不明確。因此，利用TALEN技術(shù)構(gòu)建RIP1缺陷型細胞株，對深入研究RIP1在細胞死亡的調(diào)控機制和腫瘤細胞耐藥的分子機制等方面有著極為重要的意義。
　　本論文以人纖維肉瘤細胞HT1080和人乳腺癌細胞MDA-MB-231為改造對象，構(gòu)建針對RIP1的TALEN質(zhì)粒并導(dǎo)入細胞株中，通過藥物篩選和單克隆篩

5、選獲得HT1080RIP1-/-細胞株和MDA-MB-231 RIP1-/-細胞株，進而利用基因測序、Western blot等方法從基因組DNA和蛋白質(zhì)等水平進行確證。結(jié)果包括:
　　1 針對人RIP1 CDS序列的TALEN構(gòu)建及活性鑒定:針對RIP1的CDS區(qū)域選取設(shè)計了2個打靶位點，通過TALEN模塊組裝方法構(gòu)建了10個TALEN左右臂質(zhì)粒。經(jīng)過酶切初步檢測其構(gòu)建情況后進行了HEK293T細胞試轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率高達

6、40％。為了進一步確認(rèn)構(gòu)建出的TALEN質(zhì)粒的打靶活性，又對轉(zhuǎn)染后的293T細胞進行了測序驗證，結(jié)果顯示最終得到了L1R1左右臂TALEN質(zhì)粒組合成功進行了RIP1基因的敲除。
　　2 TALEN介導(dǎo)的HT1080RIP1-/-細胞株構(gòu)建與篩選:利用成功構(gòu)建并經(jīng)活性驗證的TALEN打靶組合L1R1左右臂開展了對人纖維肉瘤細胞HT1080的RIP1基因敲除和單克隆HT1080RIP1-/-細胞株篩選。HT1080轉(zhuǎn)染率約15％，通過

7、單克隆篩選得到了1株轉(zhuǎn)染后的單克隆株并通過基因組測序和Western blot確證。
　　3 TALEN介導(dǎo)的MDA-MB-231細胞RIP1基因敲除:進而利用L1R1打靶質(zhì)粒組合對人乳腺癌MDA-MB-231細胞RIP1進行了敲除實驗。MDA-MB-231細胞系轉(zhuǎn)染率經(jīng)流式細胞術(shù)檢測約13％，然后單克隆篩選得到了1株轉(zhuǎn)染后的單克隆株，經(jīng)基因組測序和Western blot驗證成功得到了一株MDA-MB-231RW1-/-細胞。<