重組慢病毒介電動的NMD途徑因子UPF1和SMG1可誘導(dǎo)干擾細(xì)胞株的構(gòu)建.pdf

1、從編碼遺傳信息的DNA轉(zhuǎn)錄到最終蛋白質(zhì)的合成，這一連串的基因表達(dá)過程，代表了有機(jī)體內(nèi)最具影響力的生物化學(xué)過程。很自然地，有機(jī)體進(jìn)化出各種調(diào)節(jié)機(jī)制，在諸多層次確保基因表達(dá)的準(zhǔn)確性，一種稱為“無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)”途徑或“mRNA檢查(mRNAsurvveillance)”機(jī)制就是其中的一個非常重要的過程。
　　NMD（無義介導(dǎo)的mRNA降解）途徑是一種通過降解突變

2、的mRNA從而確?；虮磉_(dá)保真性的mRNA監(jiān)督機(jī)制。顧名思義，NMD途徑負(fù)責(zé)識別包含有早發(fā)性終止密碼子(PTCs)的mRNA，并將其降解。用“NMD”或“mRNA監(jiān)視”統(tǒng)稱這種含有PTC的mRNA代謝途徑，強(qiáng)調(diào)的是一種mRNA的質(zhì)量控制機(jī)制，避免在細(xì)胞中從PTC-mRNA中翻譯出C端截短的蛋白質(zhì)，這很可能對細(xì)胞產(chǎn)生有害的作用。因此NMD途徑在人類的一系列疾病中起到很重要的保護(hù)作用，這些疾病多由移碼或無義突變而產(chǎn)生含有早發(fā)性終止密碼子的m

3、RNA，如:β-地中海貧血癥、囊性纖維病變、肌肉營養(yǎng)失調(diào)和癌癥。
　　在NMD途經(jīng)中，結(jié)合在外顯子拼接復(fù)合體上的多種蛋白決定其對異常轉(zhuǎn)錄物的識別和降解的啟動，其中UPF1和SMG1發(fā)揮主要功能。UPF1是一個RNA解旋酶和RNA依賴的ATP酶;而SMG1具有磷脂酰肌醇激酶活性，負(fù)責(zé)UPF1的磷酸化。RNA干擾是哺乳動物中功能缺失研究的一種有效基因手段，并且可以作為潛在的治療各種人類疾病的方法。這是由于RNA干擾能夠特定的降解靶標(biāo)R

4、NA。另外，通過病毒載體構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)體系可以有效的應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞，使靶標(biāo)基因長期沉默。
　　本研究構(gòu)建了含有UPF1和SMG-1基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)開關(guān)基因表達(dá)干擾質(zhì)粒。我們通過公認(rèn)的運算法則設(shè)計了19bp siRNAs作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的靶位點，并且用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)檢查了目標(biāo)位點的唯一性。然后分別合成Smg1，Upf2和control的寡核苷酸鏈。
　　大部分

5、shRNA的表達(dá)都依賴于RNA聚合酶Ⅲ(pol-Ⅲ)啟動子，例如:H1或者U6啟動子。我們構(gòu)建的慢病毒載體包含了一個U6tetO-shRNA元件和一個CMV驅(qū)動的TetR-IRES-GFP盒子。我們將合成的寡核苷酸鏈處理成雙鏈形式通過限制性酶切位點克隆到pFRT-U6tetO的載體。最后我們將U6tetO-shC，U6tetO-shS和U6tetO-shU插入到pTIG構(gòu)建成完整的可誘導(dǎo)RNA干擾的慢病毒表達(dá)載體:pTIG-U6tetO

6、-shC、pTIG-U6tetO-shS和pTIG-U6tetO-shU。這個可調(diào)控的RNA干擾體系包括了TetO和TetR。在缺失四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物（強(qiáng)力霉素）的情況下，TetR與TetO緊密結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程被抑制。而加入四環(huán)素或四環(huán)素衍生物（強(qiáng)力霉素）時，它們會與TetR以1∶1的比例結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生改變，釋放TetO，從而使shRNA正常轉(zhuǎn)錄。
　　我們利用慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞HEK293T細(xì)胞得到重組病毒，經(jīng)鑒