低劑量輻射與RNA干擾對(duì)小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1相關(guān)因子骨唾液酸蛋白(BSP)影響的初步研究.pdf

1、目的：骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的一種主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及肥大軟骨細(xì)胞合成的高度磷酸化和糖基化的分泌性非膠原蛋白，BSP作為一種新的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑，在成骨細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中起到非常重要的作用。本文旨在通過(guò)低劑量輻射與RNA干擾技術(shù)以改變MC3T3-E1小鼠成骨樣細(xì)胞BSP的表達(dá)水平，以判定BSP表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞包括對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而對(duì)BSP基因在成骨增殖和分化過(guò)程中的相關(guān)

2、功能進(jìn)行初步研究。
　　 方法：1．對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行0Gy、0.1Gy、0.5Gy,1.0Gy低劑量輻射：24h后進(jìn)行MTT測(cè)吸光值，觀察細(xì)胞在5天內(nèi)的增殖情況差異；24h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡差異；24h后換液培養(yǎng)至14d，RT-PCR檢測(cè)4d、7d、10d、14d時(shí)cbfal、BSP和OCN的表達(dá)差異。
　　 2．設(shè)計(jì)四條可能的小干擾RNA(siRNA)，分別將這四段siRNA插入到RNA干擾載體

3、pGPU6/GFP/Neo中構(gòu)建成四條干擾載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP-1，2，3，4。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，設(shè)計(jì)梯度轉(zhuǎn)染體系，以最高轉(zhuǎn)染效率和最低死亡率為原則，優(yōu)化表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞的條件。
　　 3．按最優(yōu)轉(zhuǎn)染體系通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)四條載體轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)抽提RNA，RT-PCR鑒定BSP基因在轉(zhuǎn)錄水平的改變；篩選出其中一條對(duì)BSP抑制作用最佳的載體。利用已構(gòu)建

4、并篩選出的載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)抽提總RNA，RT-PCR鑒定BSP基因在轉(zhuǎn)錄水平的改變，同時(shí)利用RT-PCR鑒定cbfal、BSP和OCN mRNA的改變。
　　 結(jié)果：1．與空白對(duì)照組比較，第2d后，0.1Gy、0.5Gy的輻射對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力沒(méi)有明顯影響(P>0.05)，而1.0Gy輻射對(duì)MC3T3細(xì)胞增殖能力有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)；與空白

5、對(duì)照組比較，1.0Gy可以明顯促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)可以明顯抑制細(xì)胞凋亡；與空白對(duì)照組比較，0.1Gy，0.5Gy及1.0Gy的輻射均能上調(diào)cbfal、BSP和OCN mRNA的表達(dá)趨勢(shì)，且隨輻射劑量的增加而增強(qiáng)，其中1.0Gy組的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。
　　 2．成功構(gòu)建四條BSP干擾表達(dá)載體。分別對(duì)4種轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比較，綜合最高轉(zhuǎn)染效率與最低細(xì)胞死亡率的優(yōu)化原則，最終選擇0.8u

6、g質(zhì)粒/2ul脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染比例。
　　 3．成功篩選出一條對(duì)BSP基因抑制效率較高的siRNA表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP-l。RT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了有效干擾載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP-l的細(xì)胞，BSP基因表達(dá)下調(diào)，cbfal和OCN mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：1．低劑量輻射劑量1.0Gy可明顯上調(diào)BSP表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)cbfa

7、l和OCN mRNA的表達(dá)，為研究BSP與其它相關(guān)基因之間的關(guān)系提供了可能，同時(shí)上調(diào)BSP表達(dá)有利于骨損傷疾病的研究。
　　 2．成功構(gòu)建四條BSP干擾表達(dá)載體。在最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，成功篩選出一條有效的BSP基因的siRNA載體，繼而可以轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，并抑制cbfal和OCN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，為研究BSP在成骨細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中的作用提供了技術(shù)支持，為進(jìn)一步研究siRNA干擾BSP表達(dá)在臨床上的