輻射與RNA干擾對MC3T3-E1 Subclone14成骨樣細胞相關因子骨鈣素(OCN)影響的初步研究.pdf

1、目的：骨代謝異常對患者的生活質量及疾病控制有一定影響。骨鈣素(OCN)是成骨細胞活性及分化的指標之一,本文旨在對MC3T3-E1 Subclone14細胞輻射與RNA干擾方法敲減ppGalNAc-T1處理后對OCN表達的影響進行研究,以判定多肽N-乙酰氨基半乳糖轉移酶1(ppGalNAc—T1)與OCN表達變化相關性,從而對ppGalNAc—T1基因在成骨細胞活性及分化機制中的作用及輻射的影響有一初步了解。
　　 方法：⑴對MC

2、3T3-E1 Subclone14細胞進行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后進行MTT測吸光值,觀察細胞在5天內的增殖情況差異。⑵對MC3T3-E1 Subclone14細胞進行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后,流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡差異。⑶對MC3T3一E1 Subclone14細胞進行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后換液培養(yǎng)至14d,RT-PCR檢測4

3、d、7d、10d、14d時ppGalNAc-T1和OCN的表達差異。⑷設計四條可能的ppGalNAc-T1小干擾RNA(siRNA),分別將這四段siRNA插入到RNA干擾載體pGPU6／GFP／Neo中構建成四條干擾載體pGPU6／GFP／Neo-sippGalNAc-T1—1,2,3,4。⑸按最優(yōu)轉染體系通過脂質體介導四條載體轉染到MC3T3-E1 Subclone14細胞,轉染后48小時抽提RNA,RT-PCR鑒定ppGalNAc

4、-T1基因在轉錄水平的改變；篩選出其中一條對ppGalNAc-T1抑制作用最佳的載體。⑹利用已構建并篩選出的載體pGPU6／GFP／Neo-sippGalNAc-T1轉染MC3T3-E1 Subclone14細胞,轉染后48小時抽提總RNA,RT-PCR鑒定ppGalNAc-T1基因在轉錄水平的改變,同時RT-PCR、Western-Blot分別檢測OCNmRNA和蛋白表達量的改變。
　　 結果：①與空白對照組比較,0.5Gy、

5、2.0Gy劑量輻射對MC3T3-E1 Subclone14細胞增殖能力沒有明顯影響(P>0.05),而1.0Gy劑量輻射對細胞增殖能力有顯著的促進作用(P<0.05)。②與空白對照組比較,0.5Gy、2.0Gy劑量輻射對MC3T3-E1 Subclone14凋亡沒有明顯影響(P>0.05),而1.0Gy劑量輻射對MC3T3細胞凋亡有顯著的抑制作用(P<0.05)。③與空白對照組比較,0.5Gy,1.0Gy及2.0Gy劑量輻射均能上調OC

6、N和ppGalNAc-T1 mRNA的表達趨勢,其中1.0Gy組的表達顯著高于空白對照組(P<0.05)。④功構建四條ppGalNAc—T1干擾表達載體。⑤成功篩選出一條對ppGalNAc—T1基因抑制效率較高的siRNA表達載體pGPU6／GFP／Neo—sippGalNAc—T1-919。⑥RT-PCR及WesternBlot結果顯示:轉染了有效干擾載體pGPU6／GFP／Neo-sippGalNAc—T1—919的細胞,ppGal

7、NAc-T1基因表達明顯下調,伺時OCN mRNA和蛋白表達量明顯下調。
　　 結論：⑴輻射劑量1.0Gy可顯著促進MC3T3-E1 Subclone14細胞增殖,抑制細胞凋亡,上調OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表達。⑵成功構建ppGalNAc—T1干擾表達載體。在最優(yōu)轉染條件下,采用瞬時轉染方法,成功篩選出一條有效的ppGalNAc—T1基因的siRNA載體,繼而轉染MC3T3-E1 Subclone14細胞,結果