山東地區(qū)產(chǎn)NDM大腸埃希菌分子特征和傳播機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.了解CREC藥物敏感性，進(jìn)行菌株的表型篩選及同源性分析。
　　2.研究我院產(chǎn)NDM菌株在CREC中流行情況及耐藥基因的可傳播性。
　　3.研究大腸埃希菌毒力因子與系統(tǒng)性進(jìn)化分型、耐藥基因的相關(guān)性。
　　4.建立使用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)快速檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的方法。
　　方法:
　　1.菌株收集收集山東省立醫(yī)院2015年1月至12月，臨床分離的CREC菌株（患者來(lái)自全省各個(gè)地區(qū)），保存有菌

2、種的共23株。另外，收集碳青霉烯類敏感的大腸埃希菌20株，作為質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的陰性對(duì)照。采用梅里埃VITEK Compact和梅里埃基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對(duì)菌種進(jìn)行確認(rèn)。
　　2.表型篩選與藥敏試驗(yàn)對(duì)CREC菌株進(jìn)行表型篩選實(shí)驗(yàn)，包括改良Hodge試驗(yàn)(MHT)、ETP-EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)、ETP-EDTA復(fù)合紙片試驗(yàn)、改良碳青霉烯酶失活試驗(yàn)(mCIM)。對(duì)確認(rèn)為CREC的菌株

3、進(jìn)行微量肉湯稀釋法和E-test法藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)為(Clinical and Laboratory StandardsInstitute, CLSI M100-S26)。
　　3.同源性分析對(duì)CREC菌株進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)試驗(yàn)和多位點(diǎn)序列分析(MLST)，分析菌株的同源性。PFGE:將菌體基因組DNA包埋于小膠塊內(nèi)，進(jìn)行膠塊內(nèi)細(xì)胞裂解、XbaⅠ酶切、脈沖場(chǎng)凝膠電泳，使用Bionumerics軟件對(duì)電泳指

4、紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，分析菌株的同源性，研究菌株克隆傳播的情況。MLST:煮沸法提取菌株基因組DNA，擴(kuò)增七個(gè)管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)，測(cè)序后將序列信息錄入MLST網(wǎng)站(http://www.MLST.net/)，獲得相應(yīng)的等位基因號(hào)碼，再根據(jù)7個(gè)等位基因的組合，獲得菌株ST型。采用eBURST軟件對(duì)菌株進(jìn)行聚類同源性分析，MEGA6軟件對(duì)菌株的系統(tǒng)性進(jìn)化進(jìn)行分析。
　　4.耐藥基因檢測(cè)

5、對(duì)23株CREC菌株進(jìn)行了耐藥基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序，了解NDM及其他耐藥基因在CREC中的流行情況，對(duì)于碳青霉烯類耐藥基因擴(kuò)增陰性菌株，提取細(xì)菌外膜總蛋白，進(jìn)行SDS-PFGE蛋白電泳，分析膜孔蛋白缺失情況。
　　5傳播機(jī)制檢測(cè)對(duì)20株產(chǎn)NDM的CREC菌株進(jìn)行了質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)退幓蚴欠窨梢酝ㄟ^(guò)質(zhì)粒在菌株間水平傳播，并對(duì)接合子進(jìn)行了肉湯稀釋法和E-test法藥物敏感性試驗(yàn)來(lái)分析質(zhì)粒的耐藥性。
　　6.系統(tǒng)

6、性進(jìn)化分群與毒力因子檢測(cè)按照Clermont建立的方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增（ChuA、YjaA、TspE4C2）將CREC菌株進(jìn)行系統(tǒng)性進(jìn)化分群。同時(shí)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增常見(jiàn)腸外感染大腸埃希菌毒力因子（PAI、papA、fimH、kpsMTⅢ、papEF等共31個(gè)基因），采用SPSS軟件，對(duì)菌株MLST分型、ESBLs基因型、NDM型與致病因子的相關(guān)性進(jìn)行Fisher's精確檢驗(yàn)。
　　7.質(zhì)譜檢測(cè)采用CHCA作為小分子量參照物，對(duì)梅里

7、埃微生物鑒定質(zhì)譜儀VITEK MS進(jìn)行定標(biāo)。厄他培南作為底物，與臨床菌株作用后檢測(cè)厄他培南質(zhì)譜峰圖改變，建立質(zhì)譜快速檢測(cè)碳青霉烯酶產(chǎn)酶菌株的方法學(xué)，并對(duì)其特異性和敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　1.2015年全院共分離出大腸埃希菌1575株，其中碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌38株（約占2.4％），分別來(lái)自尿液47.2％(20/38)、痰18.9％(7/38)、創(chuàng)面分泌物11.3％(4/38)、腹腔標(biāo)本15.79％(6/38)、

8、血液3.8％(1/38)。CREC主要來(lái)自泌尿外科26.3％(10/38)，15.8％(6/38)來(lái)自兒科，15.8％(6/38)來(lái)自ICU。保存有菌株的有23株（其中一株來(lái)自同一患者的不同感染部位）。22位患者中有7位明確使用過(guò)碳青霉烯類抗菌藥物，除了一位患者以外都有過(guò)侵入性操作（放置引流管、氣管切開(kāi)、靜脈置管、留置導(dǎo)尿管等）。
　　2.所有菌株均對(duì)頭孢菌素類、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢西丁、氟喹諾酮類全部耐藥，

9、并且耐藥水平較高，MIC值均≥128μg/ml;23株菌株中僅一株對(duì)氨曲南敏感。但所有菌株對(duì)替加環(huán)素、多粘菌素B均為敏感。對(duì)阿米卡星的敏感性也較高，23株中僅4株耐藥，慶大霉素耐藥率為47.82％(11/23)。值得關(guān)注的是，磷霉素耐藥率為30.43％(7/23)。
　　3.23株菌株中共有20株NDM基因陽(yáng)性，CTX-M和TEM為最常見(jiàn)的ESBLs基因，對(duì)擴(kuò)增的片段測(cè)序以確定具體CTX-M基因亞型和TEM基因亞型。19株TEM陽(yáng)

10、性菌株全部為T(mén)EM-1型。最常見(jiàn)的CTX-M亞型為CTX-M-14，共13株;其次為CTX-M-15，共檢出6株，CTX-M-55共檢出6株。其中16株攜帶兩種以上ESBLs基因，6株攜帶兩種CTX-M亞型基因。4株阿米卡星耐藥菌株均由16S rRNA甲基化引起。23株臨床菌株全部對(duì)喹諾酮類藥物耐藥，18株喹諾酮耐藥基因陽(yáng)性，9株為qnrB基因，8株為qnrS基因，7株為qnrS和aac(6')-Ib-c同時(shí)陽(yáng)性，其余5株可能為其他機(jī)制

11、導(dǎo)致的喹諾酮類耐藥。7株磷霉素耐藥菌株全部由fosA3基因引起。
　　4.按Tenover標(biāo)準(zhǔn)，采用相似度80％為cut-off值，23株CRE可以分為11個(gè)亞群，其中一個(gè)亞群中3株菌相似度大于90％，提示存在克隆菌株流行。
　　5.23株臨床分離的CREC中含有1-6個(gè)質(zhì)粒不等，15株攜帶50 kb大小左右的質(zhì)粒，11株同時(shí)攜帶80 kb、50 kb左右兩個(gè)質(zhì)粒（其中7株為ST167，2株為ST410，1株為ST5229，

12、1株為ST405）。質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)共獲得攜帶碳青霉烯耐藥基因質(zhì)粒接合子17株。產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株中3株菌不能通過(guò)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)獲得對(duì)碳青霉烯類耐藥的接合子，或者通過(guò)電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)獲得轉(zhuǎn)化子。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中接合子對(duì)喹諾酮類全部為敏感，證明喹諾酮類耐藥基因與NDM耐藥基因不在同一個(gè)質(zhì)粒上。
　　6.23株臨床菌株沒(méi)有檢出高致病力B2群，但3株屬于致病力較強(qiáng)的D群（3株均為ST405型），16株屬于B1群（7株為ST167型，3株為ST41

13、0型，2株為ST617型，ST361、ST5229、ST744各有一株），4株屬于A群（3株為ST167型，1株為ST617型）。A群和B1群ST167菌株的PFGE指紋圖譜有所不同，可能為不同來(lái)源菌株。產(chǎn)NDM-1菌株比產(chǎn)NDM-5菌株中papGⅢ攜帶率高。ST617與ST405比ST167攜帶papGⅢ的比例高，有更強(qiáng)的粘剛、定植的能力。
　　7.厄他培南作為底物，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)NDM型碳青霉烯酶產(chǎn)酶株CREC特異性

14、和敏感性均為100％。
　　結(jié)論:
　　1.我院CREC發(fā)生率約為2.4％，與全國(guó)CREC檢出率基本一致。泌尿外科、兒科、ICU是CREC流行主要科室;尿液、腹腔標(biāo)本（膽汁、腹水）、痰是耐藥菌的主要來(lái)源。侵入性操作、使用過(guò)頭孢菌素或碳青霉烯類藥物是耐藥菌發(fā)生的高危險(xiǎn)因素。CREC菌株通常是多重耐藥菌，但對(duì)替加環(huán)素、多粘菌素B全部敏感，阿米卡星也有較好的敏感性。本實(shí)驗(yàn)篩選出一株菌株磷霉素耐藥基因與NDM基因在同一個(gè)可傳播質(zhì)粒上

15、。磷霉素作為CREC選擇性治療藥物時(shí)要慎重，這類泛耐藥菌株的傳播將給臨床治療帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)，應(yīng)加強(qiáng)篩查和控制。
　　2.NDM是我院引起CREC的主要因素，最常見(jiàn)的NDM亞型為NDM-5，約占52％(12/23)，其次為NDM-1(6/23)，這區(qū)別于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)以NDM-1為主的流行情況。ST167是我院CREC主要流行株，也是NDM-5的主要攜帶者。另外檢出ST617、ST405、ST410等6種ST型。除了NDM基因，CRE

16、C通常還攜帶喹諾酮、氨基糖苷等多種耐藥基因。TEM-1和CTX-M-14是我院最主要ESBLs基因型，其次為CTX-M-15。大部分菌株同時(shí)攜帶兩種以上ESBLs基因，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物有較強(qiáng)的水解能力。
　　3.我院既存在耐藥菌株的克隆傳播，又存在耐藥質(zhì)粒的水平傳播，質(zhì)粒水平傳播過(guò)程中存在耐藥基因的整合。IncX3型質(zhì)粒是攜帶NDM基因的主要載體，也有少量IncFⅡ、ncFⅡr型質(zhì)粒的檢出。大部分質(zhì)粒為50 kb大小，其余70-

17、130kb大小不等。具有可兼容其他質(zhì)粒的特點(diǎn)，容易在菌株間水平傳播，且該質(zhì)粒能夠在臨床菌株中穩(wěn)定存在。以往認(rèn)為，CREC較少引起暴發(fā)、流行，關(guān)注度比較低。但本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IncX3質(zhì)粒容易傳播，可能造成CREC發(fā)生率升高，甚至流行，應(yīng)加強(qiáng)攜帶這類質(zhì)粒菌株的篩查和監(jiān)控。
　　4.我院CREC未檢出高致病性B2群菌株，但檢出相對(duì)高毒力的D群菌株3株，本研究第一次報(bào)道了我國(guó)攜帶NDM的D群大腸埃希菌ST405菌株。粘多糖、P菌毛、M菌毛、