質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)NDM-13型碳青霉烯酶大腸埃希菌的研究.pdf

1、目的：
　　新型碳青霉烯酶NDM是一種能使腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類及青霉素類抗菌藥物敏感性降低甚至耐藥的B類金屬酶。自2009年首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)新德里金屬酶(NDM-1)“超級(jí)細(xì)菌”以來(lái)，產(chǎn)NDM-1的菌株在全世界范圍內(nèi)播散開來(lái)。碳青霉烯類抗菌藥物作為治療多重耐藥菌院內(nèi)感染的首選藥物，由于抗菌藥物的不合理使用，臨床上對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌越來(lái)越多。與此同時(shí)，革蘭陰性細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)16種NDM的變異體，其中編碼N

2、DM-13的blaNDM-13是最新在尼泊爾發(fā)現(xiàn)的一種在染色體上的碳青霉烯酶基因。本研究為了檢測(cè)blaNDM-13是否定位于腸桿菌科細(xì)菌臨床分離株的質(zhì)粒上，通過(guò)對(duì)耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行表型篩查和相關(guān)耐藥基因檢測(cè)方法，來(lái)了解本地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌攜帶blaNDM的情況；通過(guò)接合/轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和分子生物學(xué)方法來(lái)分析blaNDM-13的基因定位情況；通過(guò)研究承載blaNDM-13的載體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，來(lái)探索NDM耐藥基因的轉(zhuǎn)移和播散機(jī)制。

3、
　　方法：
　　采用VITEK全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對(duì)2013年1月至2016年12月分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的245株碳青霉烯類抗生素（亞胺培南或美羅培南或厄他培南）耐藥的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定和體外藥敏試驗(yàn)。隨后用常見碳青霉烯酶耐藥基因和ESBLs耐藥基因引物對(duì)blaNDM-13陽(yáng)性株進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳分析，通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)鑒定blaNDM基因型別。用大腸埃希菌EC600作為受體菌、大腸埃希菌DH5α作

4、為感受態(tài)細(xì)菌分別與blaNDM-13陽(yáng)性菌進(jìn)行接合和轉(zhuǎn)化試驗(yàn)來(lái)證實(shí)攜帶blaNDM-13的質(zhì)?？赊D(zhuǎn)移性。同時(shí)采用改良Hodge試驗(yàn)、金屬酶初篩試驗(yàn)、ESBLs雙紙片協(xié)同試驗(yàn)來(lái)對(duì)blaNDM-13陽(yáng)性菌以及接合/轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表型確證試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，我們運(yùn)用MLST多位點(diǎn)序列分型來(lái)確認(rèn)blaNDM-13陽(yáng)性菌的克隆 ST型，運(yùn)用 S1-PFGE-Southern雜交來(lái)對(duì)目標(biāo)菌攜帶的blaNDM-13進(jìn)行質(zhì)?；蚨ㄎ唬M(jìn)而通過(guò)全質(zhì)粒測(cè)序?qū)霓D(zhuǎn)

5、化子中抽提出來(lái)的blaNDM-13質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和傳播機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　結(jié)果：
　　1.菌種鑒定和耐藥基因檢測(cè)：245株待測(cè)菌為碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，其中攜帶blaNDM-13有2株。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)從臨床尿液標(biāo)本分離到的一株大腸埃希菌（被命名為E.coli DC33）同時(shí)攜帶blaNDM-13和blaSHV-12，從膿液標(biāo)本中分離到的一株大腸埃希菌(被命名為E.coli DC2504)也攜帶有blaNDM-

6、13。
　　2.MLST分型和PFGE型：選用大腸埃希菌的7個(gè)管家基因，通過(guò)PCR和DNA測(cè)序獲得每個(gè)管家基因的信息，再將每個(gè)管家基因的序列號(hào)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配分析，得出E.coli DC33為ST5138和E. coli DC2504為ST167；PFGE結(jié)果顯示E.coli DC33和E.coli DC2504這兩株細(xì)菌為不同克隆型。
　　3.接合和轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：以大腸埃希菌EC600作為受體菌，與 blaNDM-13陽(yáng)性菌

7、通過(guò)交配共軛方式，經(jīng)利福平和亞胺培南篩選平板成功獲得接合子；以大腸埃希菌DH5α作為感受態(tài)細(xì)胞，從blaNDM-13陽(yáng)性菌分離株中抽提出來(lái)的質(zhì)粒通過(guò)化學(xué)方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)亞胺培南篩選平板成功獲得轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR擴(kuò)增電泳分析，接合子/轉(zhuǎn)化子DC33和接合子DC2504均攜帶blaNDM基因。
　　4.β內(nèi)酰胺酶表型確證試驗(yàn)：E.coli DC33和接合子/轉(zhuǎn)化子DC33及E.coli DC2504和接合子DC2504的改良Hod

8、ge試驗(yàn)均為陽(yáng)性，EDTA雙紙片金屬酶初篩試驗(yàn)均為陽(yáng)性，E.coli DC33經(jīng)CLSI推薦的通過(guò)頭孢他啶/克拉維酸和頭孢他啶以及頭孢噻肟/克拉維酸和頭孢噻肟雙紙片協(xié)同法檢測(cè)ESBLs的結(jié)果為陽(yáng)性，而E.coli DC2504的ESBLs確證試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
　　5.藥敏試驗(yàn)：E.coli DC33對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥，對(duì)呋喃妥因中介，對(duì)替加環(huán)素敏感，E.coli DC2504對(duì)呋喃妥因敏感，其余同E.coli DC33

9、。用E-Test條再次驗(yàn)證E.coli DC33對(duì)IPM和MEM耐藥，且微生物自動(dòng)分析儀藥敏結(jié)果顯示接合子和轉(zhuǎn)化子對(duì)亞胺培南和美羅培南均耐藥。
　　6.質(zhì)粒酶切結(jié)果：E.coli DC33和E.coli DC2504的接合子經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切，發(fā)現(xiàn)接合子DC33和接合子DC2504攜帶blaNDM-13的質(zhì)粒相同。
　　7.質(zhì)?；蚨ㄎ唬和ㄟ^(guò)對(duì)E.coli DC33先進(jìn)行S1核酸酶消化，再通過(guò)PFGE分離獲得54

10、Kb左右的DNA條帶，用攜帶blaNDM-13的探針進(jìn)行Southern雜交確定blaNDM-13位于質(zhì)粒上。
　　8.全質(zhì)粒測(cè)序：將從轉(zhuǎn)化子中抽提出的質(zhì)粒（pNDM13-DC33）進(jìn)行序列測(cè)序，結(jié)果顯示該質(zhì)粒全長(zhǎng)54.035Kb，平均GC含量49.03％；由33Kb的骨架區(qū)和21Kb的耐藥可變區(qū)組成。耐藥可變區(qū)GC含量高，包括16個(gè)開放讀碼框，這16個(gè)開放讀碼框分別是IS26-blaSHV-12-ygbI-ygbJ-IS26-i