新的HBV表型耐藥分析方法的建立及阿德福韋耐藥株部分生物學(xué)特性的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染在臨床上可呈現(xiàn)不同的疾病狀態(tài),包括無癥狀攜帶、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化等,與肝癌的發(fā)生也密切相關(guān)。雖然安全有效的預(yù)防性乙肝疫苗廣泛應(yīng)用已使HBsAg攜帶率顯著下降,但對(duì)現(xiàn)癥慢乙肝的治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。當(dāng)前,慢乙肝治療目標(biāo)為:最大限度地長(zhǎng)期抑制或消除乙肝病毒,延緩和阻止疾病進(jìn)展,減少和防止肝臟并發(fā)癥的發(fā)生。核苷(酸)類似物類抗病毒藥物,如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋

2、及替比夫定,通過作用于HBV的RT區(qū)而發(fā)揮抗病毒作用,可顯著抑制HBV的復(fù)制、恢復(fù)患者的肝功能、改善肝組織學(xué),部分患者可發(fā)生nBeAg的血清轉(zhuǎn)換。但要鞏固以上療效需長(zhǎng)期維持治療。不幸的是,治療時(shí)間的延長(zhǎng)可導(dǎo)致HBV耐藥株的出現(xiàn),在臨床上引起治療失敗和疾病進(jìn)展。表型耐藥分析通過體外研究HBV對(duì)藥物的敏感性,一方面可以為已發(fā)生耐藥的患者提供更為合理的治療方案,另一方面也可以通過臨床分離株評(píng)估新藥的療效。迄今為止,并沒有一種合適的表型耐藥分析

3、方法。本研究第一部分建立了一種新的表型耐藥分析方法,通過置換病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)區(qū)段進(jìn)而研究RT區(qū)突變對(duì)核苷(酸)類似物類藥物敏感性的影響。第二部分對(duì)阿德福韋耐藥HBV毒株的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。
　　 第一部分
　　 新的HBV表型耐藥分析方法的建立
　　 目的：建立一種新的、簡(jiǎn)便的表型耐藥分析方法,通過置換HBV耐藥毒株的RT區(qū)來研究RT區(qū)變異對(duì)于藥物敏感性的影

4、響。
　　 方法：構(gòu)建包含野毒株HBV全基因組的真核表達(dá)質(zhì)粒PHY536207(B基因型)及PHY97(C基因型)。自GenBank下載B及C基因型HBV全基因組序列各200條,對(duì)其RT區(qū)序列進(jìn)行比對(duì),在RT區(qū)上下游查找或人工引入酶切位點(diǎn),以便能將完整的RT區(qū)進(jìn)行置換。通過定點(diǎn)誘變的方法在HBV RT區(qū)上游引入PstI酶切位點(diǎn),誘變成功的質(zhì)粒命名mPHY536207及mPHY97。利用PstI以及RT區(qū)下游自然存在的SphI位點(diǎn)

5、,酶切后進(jìn)行完整RT區(qū)的置換。為了研究定點(diǎn)誘變所產(chǎn)生的變異對(duì)HBV本身主要生物學(xué)特性的影響,將定點(diǎn)誘變前、后的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中HBsAg的水平,抽提細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒HBV DNA,Real-Time PCR檢測(cè)其水平,觀察誘變位點(diǎn)對(duì)于HBsAg分泌及HBVDNA復(fù)制的影響。以從慢乙肝病人血清中分離到的拉米夫定(Lamivudine,LAM)耐藥變異株以及阿德福韋(Adefovir dipivox

6、il,ADV)耐藥變異株為骨架,分別構(gòu)建LAM耐藥株真核表達(dá)質(zhì)粒PHY634和ADV耐藥株真核表達(dá)質(zhì)粒PHY6923,同時(shí)LAM耐藥株和ADV耐藥株以模板,擴(kuò)增耐藥變異株的RT區(qū)段,分別將其與真核表達(dá)質(zhì)粒mPHY536207中HBV野生株中的RT區(qū)相置換,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,重組質(zhì)粒分別命名為RT634(含LAM耐藥相關(guān)變異)及RT6923(含ADV耐藥相關(guān)變異)。分別將mPHY536207,PHY634(及RT634轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,轉(zhuǎn)

7、染次日加用不同濃度的LAM,藥物作用7天后抽提病毒顆粒HBV DNA,通過Real time PCR及Southern Blot檢測(cè)不同LAM濃度作用下HBV DNA的復(fù)制水平。同樣,將mPHY536207,PHY6923及RT6923轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,檢測(cè)不同濃度ADV作用下HBV DNA的復(fù)制水平。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建包含B及C基因型HBV野毒株的真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,證實(shí)有復(fù)制能力。通過定點(diǎn)誘變?cè)赗T區(qū)上游引

8、入PstI酶切位點(diǎn),轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,證實(shí)此誘變位點(diǎn)對(duì)于HBsAg分泌及HBV DNA復(fù)制無顯著影響。質(zhì)粒mPHY536207轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后,隨著LAM及ADV濃度的升高,HBV DNA的水平明顯下降,而PHY634與RT634轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后,由于兩者RT區(qū)均包含LAM耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異,細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA并沒有隨著LAM濃度的升高而下降,同樣,PHY6923及RT6923轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對(duì)ADV的敏感性相一致,細(xì)胞內(nèi)HBV DNA

9、的水平?jīng)]有隨著ADV濃度的升高而降低。
　　 結(jié)論：本研究建立的表型耐藥分析方法,通過完整的RT區(qū)置換來研究RT區(qū)不同位點(diǎn)變異對(duì)于藥物敏感性的影響,無需采用相對(duì)較難的基于全基因擴(kuò)增、克隆的表型分析技術(shù),同時(shí),該方法還具有簡(jiǎn)便易行、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。
　　 第二部分
　　 阿德福韋耐藥乙型肝炎病毒臨床分離株生物學(xué)特性的研究
　　 目的：體外研究阿德福韋耐藥相關(guān)變異對(duì)于HBsAg產(chǎn)生及HBV復(fù)制等生物學(xué)特性的影

10、響。
　　 方法：收集在阿德福韋治療過程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破患者的血清,對(duì)HBV RT區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析。對(duì)4例有代表性患者的HBV進(jìn)行全基因擴(kuò)增、測(cè)序、序列分析及克隆。將優(yōu)勢(shì)株的HBV全基因插入PHY106載體,構(gòu)建成1.1拷貝HBV基因組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg及HBeAg的水平,了解不同ADV耐藥相關(guān)變異類型對(duì)HBsAg分泌的影響。抽提轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)病毒核心顆粒HBV DNA

11、,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)HBV DNA的水平。將rtA181T/sW172*變異株與rtA181野毒株質(zhì)粒按不同比例混合,共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,檢測(cè)上清中HBsAg及細(xì)胞內(nèi)病毒核心顆粒HBV DNA的水平。
　　 結(jié)果：在12例出現(xiàn)病毒學(xué)反跳的患者中,10例含有ADV耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異,以rtA181變異為主,其中5例為rtA181T變異,4例為rtA181T/S+rtN236T變異。包含rtA181T/sW172*變異的質(zhì)粒

12、轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,上清中不能檢測(cè)到HBsAg,而其他變異類型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,上清液中HBsAg和細(xì)胞內(nèi)病毒核心顆粒HBV DNA的水平與野毒株相似;含有不同變異的HBV臨床分離株的細(xì)胞內(nèi)核心病毒顆粒HBV DNA水平未見明顯差異;將rtA181T/sW172*變異株及rtA181野毒株的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后,隨著rtA181野毒株比例的增加,上清中HBsAg的水平也逐漸增高,但細(xì)胞內(nèi)核心病毒顆粒HBV DNA水平無明顯差異。
　　 結(jié)論：r