慢性結(jié)腸炎癥誘導(dǎo)代謝重編程的功能和機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是人類(lèi)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)顯示，其發(fā)病率和死亡率在所有類(lèi)型腫瘤中居前三位，且男性患病多余女性。雖然我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率略低于世界平均水平，但總體上呈持續(xù)上升趨勢(shì)。炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease, IBD）是一組原因未明反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。IBD臨床表現(xiàn)為慢性腹瀉、腹痛，甚至便血。IBD隨著病程延長(zhǎng)，炎癥程度加重，惡性癌變的風(fēng)險(xiǎn)增加。雖然

2、IBD患者癌變只占結(jié)腸癌的1％~2%，但是結(jié)腸炎相關(guān)性腫瘤（Colitis-Associated Cancer, CAC）是IBD最為嚴(yán)重的并發(fā)癥，并且其發(fā)生率呈逐年上升態(tài)勢(shì)。
　　上個(gè)世紀(jì)20年代，德國(guó)科學(xué)家Otto Warburg提出，腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也會(huì)優(yōu)先進(jìn)行糖酵解為細(xì)胞提供能量，這種有別于正常組織細(xì)胞的糖代謝方式，稱(chēng)為“Warburg效應(yīng)”，或稱(chēng)為“有氧糖酵解”。由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)一些基因結(jié)構(gòu)與功能的改變，導(dǎo)致最終以

3、 Warburg效應(yīng)為主要生化代謝特征的一系列代謝改變稱(chēng)為代謝重編程。腫瘤細(xì)胞通過(guò)基因突變可改變多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝，主要表現(xiàn)為糖酵解增強(qiáng)、葡萄糖攝取和消耗增加、乳酸產(chǎn)生增加等。腫瘤細(xì)胞代謝重編程引起細(xì)胞內(nèi)代謝異常，是為滿(mǎn)足其快速增殖需求而主動(dòng)發(fā)生的過(guò)程，同時(shí)改變了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中的流向和流量。
　　目前，代謝重編程參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程已基本明確。然而，細(xì)胞代謝重編程是否參與慢性腸道的炎癥過(guò)程卻不得而知

4、。因此，我們做出了以下假設(shè)：在反復(fù)炎癥刺激下，在正常上皮-炎癥損傷-異常增生-腺瘤-癌變的過(guò)程中，細(xì)胞的代謝狀態(tài)可能會(huì)逐漸發(fā)生改變，以適應(yīng)其快速增殖和惡性增生的需要。而代謝重編程則會(huì)進(jìn)一步加劇細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，最終形成腫瘤。
　　為此，針對(duì)以上假設(shè)，我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別模擬炎癥過(guò)程，檢測(cè)代謝過(guò)程中一系列代謝指標(biāo)的變化，從而明確炎性狀態(tài)下是否會(huì)發(fā)生代謝重編程，并進(jìn)一步揭示其分子作用機(jī)制。
　　【目的】

5、　　1.建立DSS誘導(dǎo)的小鼠急/慢結(jié)腸炎模型
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)狀態(tài)
　　3.在細(xì)胞水平分析炎癥信號(hào)刺激下的代謝變化
　　4.揭示炎癥狀態(tài)下發(fā)生代謝重編程的分子機(jī)制
　　【方法與結(jié)果】
　　1.代謝關(guān)鍵酶在DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型中表達(dá)上調(diào)
　　為了明確細(xì)胞代謝關(guān)鍵酶在炎癥微環(huán)境中的變化規(guī)律，我們利用DSS誘導(dǎo)方法，分別建立小鼠急性和慢性結(jié)腸炎模型。首先，在DSS誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)

6、腸炎模型中，我們分別利用2.5%和4% DSS加入小鼠飲用水中，每天測(cè)體重，誘導(dǎo)腸炎7天后取結(jié)腸組織，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果顯示，隨著DSS作用時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠體重降低、結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，并在2.5%和4%兩組小鼠之間也存在略微差異。此外，我們也通過(guò)結(jié)腸組織 H&E染色和組織學(xué)評(píng)分來(lái)評(píng)估炎癥程度。發(fā)現(xiàn) DSS處理組小鼠結(jié)腸組織有大量的小葉壞死性炎癥細(xì)胞。據(jù)此，我們進(jìn)一步檢測(cè)了代謝相關(guān)指標(biāo)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，持續(xù)7天的DSS處理，

7、小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中HK2、PKM2的mRNA與蛋白水平表達(dá)升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，p-STAT3與c-Myc的表達(dá)上調(diào)。
　　2.代謝關(guān)鍵酶在DSS誘導(dǎo)小鼠慢性結(jié)腸炎模型中表達(dá)上調(diào)
　　除了急性炎癥模型，我們也建立了慢性炎癥模型來(lái)分析代謝標(biāo)志物的變化情況。在誘導(dǎo)慢性腸炎模型中，利用DSS處理小鼠三個(gè)周期。每個(gè)周期利用2.5%的DSS喂食小鼠5天，隨后的10天更換為正常的無(wú)菌水。在對(duì)照組小鼠中，小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)評(píng)估沒(méi)有明顯差異，然而

8、在DSS處理組卻有明顯的異常以及大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化染色結(jié)果顯示，在慢性炎癥狀態(tài)下，c-Myc, HK2, PFK, PKM2以及p-STAT3的表達(dá)升高。值得注意的是，在糖酵解中發(fā)揮重要作用的代謝關(guān)鍵酶如LDH-A和PKM2在慢性炎癥中表達(dá)升高較為明顯，但在誘導(dǎo)急性腸炎小鼠中的表達(dá)變化差異不大。以上這些結(jié)果說(shuō)明，細(xì)胞代謝狀態(tài)可在急性腸道炎癥中進(jìn)行波動(dòng)性調(diào)整，以對(duì)抗炎癥微環(huán)境的應(yīng)激作用。但在長(zhǎng)期的慢性炎癥環(huán)境中，可通過(guò)代謝重編程

9、進(jìn)一步重塑代謝狀態(tài)來(lái)適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境。
　　3. IL-6刺激下代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)以及乳酸產(chǎn)生量增加
　　有研究表明，IL-6作為炎癥因子在腫瘤微環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要的促進(jìn)作用。因此，我們利用人正常腸上皮細(xì)胞HIEC與結(jié)腸癌細(xì)胞為研究模型，明確IL-6對(duì)細(xì)胞代謝狀態(tài)的影響及其生物學(xué)功能。我們發(fā)現(xiàn)，IL-6對(duì)細(xì)胞存活具有一定的促進(jìn)作用，在HIEC細(xì)胞中尤為明顯。在相應(yīng)的細(xì)胞流式分析與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)IL-6對(duì)結(jié)

10、腸細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖具有直接的促進(jìn)作用。同時(shí)，IL-6還可以降低5-FU對(duì)HIEC細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力。重要的是，在HT-29與HIEC細(xì)胞系中，IL-6刺激可以顯著的提高代謝關(guān)鍵酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平，LDH-A與PKM2的表達(dá)水平明顯升高。相對(duì)于HIEC細(xì)胞系，IL-6刺激作用引起的代謝關(guān)鍵酶表達(dá)升高在SW620中較為明顯，提示我們，相對(duì)于正常細(xì)胞，具有高度惡性轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞在炎癥信號(hào)刺激下，可以更加高效的進(jìn)行有氧糖酵解。此外，I

11、L-6促使細(xì)胞產(chǎn)生乳酸的能力增強(qiáng)。我們的結(jié)論證實(shí)，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致，IL-6作為炎癥因子所誘導(dǎo)的炎性微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的有氧糖酵解具有直接的促進(jìn)作用。
　　4. IL-6通過(guò)激活STAT3/c-Myc信號(hào)通路誘導(dǎo)代謝重編程
　　在明確炎癥可以誘導(dǎo)代謝重編程的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步對(duì)炎癥微環(huán)境下炎癥-腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程引起細(xì)胞代謝發(fā)生重編程的機(jī)制進(jìn)行了深入分析。近年來(lái)研究表明， IL-6/STAT3通路在炎癥相關(guān)性結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)

12、鍵作用。據(jù)此，我們利用STAT3的小分子抑制劑S3I-201抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路。發(fā)現(xiàn)，S3I-201可以抑制HK2與c-Myc的表達(dá)。同時(shí)，S3I-201還可以進(jìn)一步阻斷IL-6對(duì)c-Myc與細(xì)胞內(nèi)代謝關(guān)鍵酶的上調(diào)作用。由于炎癥狀態(tài)下c-Myc的mRNA水平與蛋白水平均表達(dá)上升，我們進(jìn)一步利用c-Myc的抑制劑JQ1作用細(xì)胞。結(jié)果顯示，JQ1可以抑制IL-6引發(fā)的代謝關(guān)鍵酶表達(dá)上調(diào)，而 p-STAT3的表達(dá)不受影響。因此，

13、我們認(rèn)為 IL-6/STAT3信號(hào)通路可以誘導(dǎo)代謝發(fā)生重編程，而STAT3/c-Myc信號(hào)通路在炎癥誘導(dǎo)代謝重編程的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　【結(jié)論】
　　我們研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)的小鼠急性和慢性腸道炎癥模型中，炎癥信號(hào)可以誘導(dǎo)代謝重編程。但是，在急性炎癥與慢性炎癥模型中略有差異。在急性炎癥的早期階段，糖酵解過(guò)程中開(kāi)始幾步的代謝酶變化較后幾步較為明顯，而在慢性炎癥中則是更多的代謝關(guān)鍵酶持續(xù)高表達(dá)，提示我們長(zhǎng)期的炎癥信號(hào)的持

14、續(xù)刺激有可能導(dǎo)致代謝重編程。同時(shí)，我們?cè)隗w外細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)IL-6作為炎癥因子所誘導(dǎo)的炎性微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的有氧糖酵解具有直接的促進(jìn)作用，并且證實(shí) IL-6/STAT3/c-Myc在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)炎癥可以促使腸道上皮細(xì)胞發(fā)生代謝重編程。這些代謝狀態(tài)的改變，其特點(diǎn)類(lèi)似于“Warburg效應(yīng)”或有氧糖酵解，例如糖酵解能力增強(qiáng)、乳酸產(chǎn)生增加，可以進(jìn)一步促進(jìn)炎癥相關(guān)性結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此，炎癥誘發(fā)的