FTIR及mapping技術(shù)探測陳舊性及急性心肌梗死的分子學(xué)差異.pdf

1、背景：心肌梗死（myocardiAlinfarction, MI）是心肌嚴(yán)重缺血所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞壞死。MI是心肌缺血的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，占所有死亡的10-15％，占猝死的60％。因此，MI作為心血管系統(tǒng)的重要病變之一，成為世界范圍內(nèi)的健康隱患。
　　 依據(jù)病變時(shí)間差異，MI可分為急性心肌梗死（acute myocardiAlinfarction, AMI）及陳舊性心肌梗死（old myocardiAlinfarction, OMI

2、）。AMI往往表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的溶解性壞死，心肌細(xì)胞腫脹，肌原纖維和細(xì)胞器廣泛溶解、消失，甚至只有核和胞膜的存留，整個(gè)心肌細(xì)胞猶如一個(gè)空鞘，同時(shí)細(xì)胞周圍出現(xiàn)纖維增生、變粗，形成網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。最終核消失，網(wǎng)架塌陷崩解；心肌細(xì)胞的再生能力極差，壞死區(qū)域最常見的修復(fù)形式為瘢痕形成，即壞死組織完全為膠原纖維所取代，纖維排列不規(guī)則。陳舊的瘢痕組織較致密，其膠原纖維可發(fā)生玻璃樣變性，或鈣鹽沉著，這就是OMI的主要病理學(xué)改變。從組織病理學(xué)角度，MI導(dǎo)致急性

3、炎癥，并且壞死組織逐漸被膠原瘢痕所取代，該過程大概需要6-8周時(shí)間。
　　 疾病的進(jìn)程均為正常組織-微小病變-典型病變，早期AMI從組織病理學(xué)水平難以診斷，而且AMI向OMI發(fā)展過程中表現(xiàn)出來的組織病理學(xué)改變愈加復(fù)雜，難以進(jìn)行有效的區(qū)分。在實(shí)際工作中，無論大體標(biāo)本的宏觀觀察，還是組織切片的微觀觀察，所見到的病理改變往往比較復(fù)雜，單純依靠主觀的組織病理學(xué)檢查，往往難以對微小病變或輕度病變加以準(zhǔn)確的區(qū)分和辨認(rèn)。因此亟需尋找一種便捷、

4、敏感、可重復(fù)性的方法，以適用于法醫(yī)病理學(xué)鑒定的需要。
　　 傅立葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）技術(shù)興起于20世紀(jì)80年代，是確定分子組成和結(jié)構(gòu)的有效技術(shù)工具，具有分析過程簡便、噪聲低、光通量高、測量速度快、波數(shù)精度高、頻率測量范圍寬、操作費(fèi)用低、無損檢測等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于化工、冶金、地礦、石油、醫(yī)藥、珠寶鑒定、法庭科學(xué)等諸多領(lǐng)域。對于固體、液體或氣體樣

5、本，單一組分的純凈物及多種組分的混合物都可以應(yīng)用FTIR技術(shù)進(jìn)行測定。FTIR既可以用于樣品的定性分析，也可用于定量分析。除此之外，F(xiàn)TIR檢測過程制樣簡單，生物樣本無需額外的染色技術(shù)，極大地縮短了測定時(shí)間。基于法醫(yī)病理學(xué)特定的保留樣本及復(fù)審需要，F(xiàn)TIR的無損性、可重復(fù)性尤為適用。
　　 當(dāng)有機(jī)分子吸收紅外線后，會產(chǎn)生分子振動(dòng)能級的躍遷，這種躍遷因不同有機(jī)分子的振動(dòng)形式、振動(dòng)方向及振幅大小而異，其振動(dòng)能級躍遷有所差異，因此不同

6、結(jié)構(gòu)的化合物在紅外線的照射下呈現(xiàn)出不同波長的吸收帶，即紅外光譜。FTIR即是將干涉圖應(yīng)用數(shù)學(xué)上的傅立葉轉(zhuǎn)換所形成的紅外光譜。對于多原子的有機(jī)物來講，有些振動(dòng)來自于整個(gè)分子，有些振動(dòng)來自于分子局部的化學(xué)鍵或官能團(tuán)，同一類型的化學(xué)鍵的振動(dòng)具有相近的振動(dòng)頻率。因此，F(xiàn)TIR依據(jù)分子共價(jià)鍵的不同運(yùn)動(dòng)方式所產(chǎn)生的紅外吸收的特征峰，來確定該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或分子中的官能團(tuán)特征。
　　 細(xì)胞由細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核構(gòu)成，各部分主要化學(xué)組成為蛋

7、白質(zhì)及脂質(zhì)、糖原、核酸，這些組分的含量、構(gòu)型及構(gòu)象在不同組織細(xì)胞表現(xiàn)不同。在許多疾病過程中，這些組分會發(fā)生變化，而這些變化可以通過紅外光譜的差異表現(xiàn)出來。目前FTIR應(yīng)用于腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、骨鈣化異常等疾病的分子特征進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)了一些特征性的變化。國外學(xué)者曾利用MRI技術(shù)對活體內(nèi)陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死進(jìn)行區(qū)別，但利用FTIR及面成像技術(shù)進(jìn)行心肌梗死的分子特征測定并初步進(jìn)行區(qū)分，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 本研究

8、突破傳統(tǒng)分子特征研究思路，在國際上首創(chuàng)性的聯(lián)用FTIR、紅外顯微鏡及面成像技術(shù)對心肌梗死的分子特征進(jìn)行研究；將尸體樣本引入分子水平研究，在同一張切片上設(shè)定實(shí)驗(yàn)組及對照組，消除了死后變化的影響；快速、敏感的對細(xì)胞各主要大分子成分的含量及空間構(gòu)型進(jìn)行同時(shí)分析，消除了單次分析一個(gè)指標(biāo)的操作差異，并最大程度節(jié)省了檢測時(shí)間；在前期開創(chuàng)性工作的基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)、糖原、核酸及脂質(zhì)等成分的變化關(guān)系進(jìn)行探討，進(jìn)一步用于探測陳舊性及急性心肌梗死的分子特征，

9、并為最終在分子水平區(qū)分陳舊性及急性心肌梗死奠定基礎(chǔ)。面成像技術(shù)的應(yīng)用使得化學(xué)圖像能直觀的反映各大分子的分布及變化情況，并建立了與組織病理學(xué)的良好對應(yīng)關(guān)系，延伸了“紅外病理學(xué)”這門交叉學(xué)科的涵蓋范圍。本研究屬于化學(xué)技術(shù)與法醫(yī)學(xué)研究的交叉性創(chuàng)新研究。
　　 目的：
　　 本研究針對現(xiàn)今法醫(yī)學(xué)心肌梗死的鑒定、陳舊性及急性心肌梗死的時(shí)間區(qū)分問題，通過將光譜學(xué)FTIR、紅外顯微鏡及面成像技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，對陳舊性及急性心肌梗死的分子

10、變化進(jìn)行測定，主要探討紅外光譜反映出來的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖原及核酸的變化，以及相互之間的變化關(guān)系。并通過紅外化學(xué)圖像的特點(diǎn)，研究化學(xué)圖像與組織病理學(xué)的對應(yīng)關(guān)系，為最終應(yīng)用FTIR技術(shù)在分子水平上對陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死加以區(qū)分奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
　　 1999年-2008年本系檢案案例陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死心臟樣本。
　　 傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet 670

11、0, Thermo Fisher Scientific，美國）；
　　 傅立葉變換紅外顯微鏡附件（Nicolet continuum microscope, Thermo Fisher Scientific，美國）；
　　 傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iN10, Thermo Fisher Scientific，美國）；
　　 紅外光譜工作站（OMNIC 8.0，Thermo Fisher Scient

12、ific，美國）；
　　 虛擬顯微成像系統(tǒng)（Dotslide 2.1，Olympus，日本）；
　　 脫水機(jī)（AP-280X，Microm，德國）
　　 包埋機(jī)（STP-120，Microm，德國）；
　　 切片機(jī)（HM-340E，Microm，德國）；
　　 展片機(jī)（ZPJ-1，天津天利航空機(jī)電有限公司）；
　　 烤片機(jī)（KPJ-1，天津天利航空機(jī)電有限公司）；
　　 蘇木素、伊

13、紅、天然樹膠（上海試劑一廠）；
　　 二甲苯、乙醇、氨水、鹽酸（分析純）。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 FTIR及紅外顯微鏡聯(lián)用檢測
　　 根據(jù)鑒定結(jié)果確定陳舊性心肌梗死部位，各心臟樣本在心肌梗死邊緣取材2塊，包括心肌梗死區(qū)及鄰近正常組織區(qū)。樣本常規(guī)制作蠟塊，行連續(xù)切片，厚6μm。將其中一張切片平鋪于普通載玻片上，行常規(guī)HE染色。將HE染色切片經(jīng)Dotslide虛擬顯微成像系統(tǒng)在40分辨率下進(jìn)行掃描，并依據(jù)病理

14、學(xué)改變設(shè)定心肌梗死病變區(qū)域?yàn)閷?shí)驗(yàn)組，同一張切片無明顯病變區(qū)域?yàn)閷φ战M。另一張連續(xù)切片平鋪于表面鍍金的特殊載玻片上，此切片僅行常規(guī)脫蠟、脫水處理，不經(jīng)任何染色方法處理，晾干行FTIR檢測。
　　 應(yīng)用Nicolet 6700FTIR光譜儀、Nicolet continuum紅外顯微鏡（物鏡15×，目鏡10×）及其匹配工作站OMNIC 8.0檢測。反射模式，經(jīng)液氮冷卻，在室溫24℃下進(jìn)行，測定范圍為4000cm-1-650cm-1。

15、參數(shù)設(shè)置為單張光譜覆蓋面積為25μm×25μm，分辨率為4cm-1，掃描次數(shù)為32次。每個(gè)樣品在測試前先進(jìn)行背景掃描，并儲存該光譜作為固定背景。根據(jù)HE染色切片劃分對照組及實(shí)驗(yàn)組，在紅外顯微鏡指導(dǎo)下將相同區(qū)域劃分為對照組（A組）及實(shí)驗(yàn)組（B組），各組隨機(jī)選取10個(gè)檢測區(qū)域，所采集光譜經(jīng)OMNIC 8.0工作站存儲并處理分析。應(yīng)用OMNIC軟件對光譜進(jìn)行自動(dòng)基線校正、自動(dòng)平滑處理后，分析蛋白質(zhì)酰胺、脂質(zhì)、糖原、核酸等譜帶的峰位、峰強(qiáng)度，及

16、部分特征性譜帶的峰高比，以詮釋陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死的分子特征，并建立與組織病理學(xué)的對應(yīng)關(guān)系。
　　 FTIR、紅外顯微鏡及面成像（mapping）技術(shù)聯(lián)用檢測
　　 切片樣本制樣過程同上。聯(lián)用Nicolet iN10FTIR光譜儀、Nicolet continuum紅外顯微鏡（物鏡15×，目鏡10×）及其匹配工作站OMNIC 8.0檢測。反射模式，經(jīng)液氮冷卻，在室溫24℃下進(jìn)行，測定范圍為4000cm-1-650

17、cm-1。參數(shù)設(shè)置為單張光譜覆蓋面積為100μm×100μm，分辨率為16cm-1，掃描次數(shù)為1次。背景采集及分組同上。對整張切片組織進(jìn)行掃描采集化學(xué)圖像。應(yīng)用OMNIC Picta對化學(xué)圖像進(jìn)行自動(dòng)基線校正、自動(dòng)平滑處理，并研究其與形態(tài)學(xué)的對應(yīng)關(guān)系。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖像處理
　　 所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)一維方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　

18、 FTIR及紅外顯微鏡檢測
　　 在陳舊性心肌梗死病變區(qū)，蛋白質(zhì)酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ各譜帶變化趨勢一致，均為峰位藍(lán)移、峰強(qiáng)度增加。脂質(zhì)CH3反對稱及對稱伸縮振動(dòng)、CH2反對稱及對稱伸縮振動(dòng)譜帶變化趨勢一致，均為峰位無移動(dòng)、峰強(qiáng)度增加。核酸PO2反對稱伸縮振動(dòng)譜帶的峰位出現(xiàn)藍(lán)移，但對稱伸縮振動(dòng)譜帶的峰位無移動(dòng)，峰強(qiáng)度均降低。糖原C-O伸縮振動(dòng)譜帶的峰位無移動(dòng)、峰強(qiáng)度降低。I1652/I1634、I1650/I1550比值均增高；I

19、1550/I3300、I1160/I1080比值均降低；I2920/I2960比值無變化。
　　 在急性心肌梗死病變區(qū)，蛋白質(zhì)酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ各譜帶變化趨勢一致，均為峰位無移動(dòng)、峰強(qiáng)度降低。脂質(zhì)僅CH3反對稱伸縮振動(dòng)譜帶的峰位出現(xiàn)紅移、峰強(qiáng)度降低，其余CH3對稱、CH2反對稱及對稱伸縮振動(dòng)各譜帶變化趨勢一致，均為峰位無移動(dòng)、峰強(qiáng)度降低。核酸PO2反對稱伸縮振動(dòng)譜帶的峰位無移動(dòng)，而PO2對稱伸縮振動(dòng)譜帶的峰位紅移，兩譜帶的峰強(qiáng)度

20、均降低。糖原C-O伸縮振動(dòng)譜帶的峰位無移動(dòng)、峰強(qiáng)度降低。I1652/I1643比值降低；I1650/I1550比值增高；I1550/I3300、I2920/I2850、I1160/I1080均無變化。
　　 FTIR及mapping檢測
　　 面掃描成像技術(shù)采集的化學(xué)圖像基本可以反映MI各大分子分布特征，并且與陳舊性心肌梗死的組織病理學(xué)分布特征基本一致，與急性心肌梗死的組織病理學(xué)分布特征較一致。應(yīng)用數(shù)學(xué)模型一階導(dǎo)數(shù)、二階