ACTC1基因與先天性心臟病的相關(guān)研究及其作用機制探討.pdf

1、前言：先天性心臟病(Congenital Heart Disease，CHD)是常見重大出生缺陷，在活產(chǎn)兒中發(fā)病率為4.05‰～12.3‰，占新生兒非感染性死亡原因首位。80％CHD僅表現(xiàn)為心臟畸形而不伴有其他系統(tǒng)先天異常，稱為單純性CHD。長期研究證實CHD主要由于胚胎時期遺傳與環(huán)境因素共同作用引起，其中遺傳因素具有重要作用，遺傳率為55％～65％。
　　 關(guān)于CHD的分子遺傳學(xué)研究有助于闡明其發(fā)生機制，從而使預(yù)防成為可能。不

2、僅如此，有證據(jù)提示某些CHD相關(guān)基因還參與成體心臟正常功能的維護。心臟的形成過程十分復(fù)雜，涉及在很短時間內(nèi)細胞的精確遷移、分化和多種來源細胞的整合，其間的遺傳或環(huán)境因素所引起的任何紊亂都可能導(dǎo)致CHD。這也是CHD一直保持較高發(fā)病率的原因。既往研究已證實轉(zhuǎn)錄因子異常是CHD的主要遺傳學(xué)病因，其中NKX2-5、TBX5、GATA4為單純性CHD3個最主要的致病基因。大量研究證實TBX5可通過蛋白-蛋白相互作用在心臟早期發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色。

3、
　　 本課題組之前對61個單純性CHD核心家系、共216位成員TBX5基因的8個外顯子進行了突變檢測，盡管未發(fā)現(xiàn)任何突變，但證實TBX5基因的表達呈下降趨勢。據(jù)此推測該變化可導(dǎo)致與TBX5相互作用的其它因子作用異常，再通過某種途徑影響心臟正常發(fā)育，最終導(dǎo)致心臟畸形。
　　 為深入明確此途徑，本研究應(yīng)用免疫共沉淀法，篩選出與TBX5相互作用的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析及Western Blot驗證確定該蛋白為心臟α肌動蛋白(Alp

4、ha-cardiacactin，ACTC1)。
　　 區(qū)別于以往CHD相關(guān)基因多為轉(zhuǎn)錄因子，ACTC1基因為一種心臟特異表達的結(jié)構(gòu)基因。多數(shù)研究提示此基因異常與心肌病(肥厚型心肌病及擴張型心肌病)的發(fā)生密切相關(guān)。2008年Matsson等在對房間隔缺損(atrial septal defect，ASD)家系的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因突變可導(dǎo)致家族性房間隔缺損。本研究旨在進一步探討ACTC1基因與散發(fā)單純性先天性心臟病的關(guān)系，并從基因調(diào)

5、控、心肌細胞凋亡方面探討其導(dǎo)致心臟發(fā)育異常機制。
　　 方法：
　　 標本：33例先天性心臟病及12例心臟結(jié)構(gòu)正常心肌組織標本由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院、陸軍總院心臟外科及沈陽軍區(qū)第202醫(yī)院病理科提供，標本使用經(jīng)患者監(jiān)護人知情并同意。成年SD大鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗過程遵照動物保護條例。H9C2(大鼠胚胎心肌細胞)購自上海生科院細胞庫。
　　 1、ACTC1基因與先天性心臟病的相關(guān)性研究(1)DNA直

6、接測序檢測ACTC1基因編碼區(qū)突變PCR擴增33例先天性心臟病心肌組織標本ACTC1基因編碼外顯子，直接測序法篩查編碼外顯子突變情況。
　　 (2)實時定量RT-PCR，免疫組織化學(xué)及Western-Blot法研究ACTC1基因在CHD心肌組織中的表達分別提取CHD及心臟結(jié)構(gòu)正常心肌組織RNA和蛋白質(zhì)，予實時定量RT-PCR及Western-Blot檢測ACTC1基因mRNA及蛋白表達；制備上述心肌組織石蠟包埋切片，免疫組織化學(xué)

7、方法檢測ACTC1蛋白定位及表達。
　　 (3)TUNEL法檢測CHD心臟組織心肌細胞凋亡及其與ACTC1基因表達相關(guān)性分析石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，蛋白質(zhì)酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，DAB顯色，復(fù)染，抗ACTC1抗體特異染色標記心肌細胞，脫水，封片。顯微鏡下計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)。對TUNEL陽性細胞比率與ACTC1基因表達水平進行相關(guān)分析。
　　 (4)實時定量RT-PCR檢測心肌組織Caspase-3、B

8、cl-2基因表達實時定量RT-PCR檢測CHD心肌組織凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達(5)RNA干擾設(shè)計合成Actc1-siRNA，轉(zhuǎn)染H9C2細胞系，提取轉(zhuǎn)染后RNA及蛋白，實時定量RT-PCR及Western Blot檢測Actc1-siRNA干擾效應(yīng)。
　　 (6)TUNEL法檢測RNAi后心肌細胞凋亡將轉(zhuǎn)染后心肌細胞固定，TdT酶及核苷酸混合液孵育，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察、計

9、數(shù)TUNEL陽性細胞。
　　 (7)AnnexinV/PI雙染及流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡將轉(zhuǎn)染后H9C2細胞進行AnnexinV/PI雙染后，流式細胞儀檢測凋亡心肌細胞率。
　　 (8)實時定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后H9C2細胞Caspase-3、Bcl-2基因表達收集轉(zhuǎn)染后細胞，提取總RNA，實時定量RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Caspase-3，Bcl-2 mRNA表達。
　　 2、NKX2.5調(diào)控Actc

10、1基因表達的研究(1)Western-Blot、免疫組織化學(xué)、細胞免疫熒光法檢測NKX2.5及ACTC1表達Western-Blot檢測E12.5d大鼠胎鼠心臟組織中NKX2.5及ACTC1表達；免疫組織化學(xué)法檢測E12.5d大鼠胎鼠心臟中ACTC1組織定位。細胞免疫熒光法檢測NKX2.5及ACTC1在大鼠胎鼠心肌細胞系H9C2中細胞定位。
　　 (2)P-MATCH軟件預(yù)測大鼠Actc1基因5’上游序列轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點獲取A

11、ctc1基因5’上游1500bp序列信息(http：//www.ensembl.org)，應(yīng)用P-MATCH軟件預(yù)測其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　 (3)熒光素酶報告基因系統(tǒng)PCR擴增Actc1基因啟動子序列，構(gòu)建熒光素酶報告載體pGL4-Actc1。pGL4-Actc1和pcDNA-NKX2.5轉(zhuǎn)染COS7及H9C2細胞，觀察NKX2.5對Actc1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　 (4)凝膠阻滯實驗E12.5d胎鼠心肌組織核蛋白和

12、3’生物素標記的探針在凝膠阻滯緩沖液中室溫結(jié)合1小時，10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果。
　　 (5)染色質(zhì)免疫沉淀實驗提取E12.5d胎鼠心肌組織染色質(zhì)，甲醛交聯(lián)、酶切后應(yīng)用NKX2.5抗體沉淀，沉淀下的染色質(zhì)通過PCR擴增檢測結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1、33例CHD心肌組織標本中未發(fā)現(xiàn)ACTC1基因編碼區(qū)突變，但存在ACTC1基因表達下調(diào)(26/33，78.8％)

13、。
　　 2、CHD患者心肌標本TUNEL陽性心肌細胞凋亡率增加，Caspase-3表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)。
　　 3、轉(zhuǎn)染Actc1-siRNA后，TUNEL/AnnexinV陽性。H9C2細胞數(shù)增加；Caspase-3表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)。
　　 4、在E12.5d胎鼠心臟中NKX2.5和ACTC1分別表達于心肌細胞核及細胞質(zhì)中。
　　 5、在大鼠Actc1基因啟動子區(qū)域(-1066)存

14、在NKX2.5的可能結(jié)合位點。
　　 6、外源表達NKX2.5可明顯激活大鼠胚胎心肌細胞H9C2中Actc1基因表達。
　　 7、NKX2.5通過與NKX2.5結(jié)合位點(-1066)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　 8、在體外NKX2.5蛋白可以和Actc1基因啟動子區(qū)位點(-1066)直接結(jié)合。
　　 9、在E12.5d大鼠胚胎心臟發(fā)育過程中NKX2.5可以和Actc1基因啟動子區(qū)NKX2.5結(jié)合位點(-1