禽致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2DotU的功能研究及毒力基因多重PCR方法的建立.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）可導(dǎo)致雞、鴨等多種禽類(lèi)的腸道外疾病，臨床癥狀復(fù)雜多樣，包括心包炎、肝周炎、氣囊炎、腹膜炎、敗血癥和腦炎等，該病波及范圍廣，嚴(yán)重制約著各地養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。除了禽類(lèi)，它還可以導(dǎo)致小鼠的腦膜炎癥狀，無(wú)疑對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了潛在的威脅。
　　毒力因子是APEC致病過(guò)程中的重要因素。已發(fā)現(xiàn)的APEC毒力因子主要包括黏附素、侵襲素、抗血清存活因子、鐵

2、攝取系統(tǒng)、空泡形成毒素以及其他毒力因子。有研究證明，APEC與人類(lèi)腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC)利用共同的毒力基因貯存庫(kù)，因此，加強(qiáng)對(duì)APEC毒力因子的監(jiān)測(cè)和研究，對(duì)于養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生均具有重要意義。APEC的致病力是由多種毒力因子共同作用的結(jié)果，新的毒力因子的發(fā)現(xiàn)將有助于APEC致病機(jī)理的闡述。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(TypeⅥsecretion system，T6SS)是

3、新近發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性菌的蛋白分泌系統(tǒng)。研究證明，T6SS在不同菌中扮演多樣的角色，包括促進(jìn)毒力、抑制細(xì)菌的復(fù)制和毒力以及調(diào)節(jié)菌間關(guān)系等。目前，T6SS在APEC中的作用尚不清楚。
　　本研究建立了4組多重PCR方法，用以檢測(cè)APEC的18個(gè)毒力基因，另外還研究了T6SS2核心蛋白DotU在APEC致病以及蛋白分泌過(guò)程中的作用。
　　1.禽致病性大腸桿菌毒力基因多重PCR方法的建立
　　為實(shí)現(xiàn)對(duì)APEC毒力基因的簡(jiǎn)易、快

4、速檢測(cè)，本研究建立了4組多重PCR方法，分別檢測(cè)黏附相關(guān)基因、侵襲及毒素相關(guān)基因、抗血清存活相關(guān)基因及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因共18個(gè)毒力基因。根據(jù)GenBank公布的基因序列，設(shè)計(jì)合成18對(duì)特異性引物，通過(guò)退火溫度、引物濃度等條件優(yōu)化，建立了4組多重PCR體系，通過(guò)模板倍比稀釋法檢測(cè)了各組多重PCR的靈敏性。利用建立的多重PCR方法對(duì)100株APEC進(jìn)行了毒力基因檢測(cè)，驗(yàn)證多重PCR方法的可行性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究建立的多重PCR方法能夠特異

5、性擴(kuò)增出目的基因，其靈敏度分別為:103 CFU、103 CFU、105 CFU、105 CFU細(xì)菌和1 ng、1ng、10ng、10 ng DNA。對(duì)100株APEC的毒力基因進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，結(jié)果與先前的單基因PCR檢測(cè)結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的多重PCR方法快速、有效，可用于APEC毒力基因的鑒定及流行病學(xué)調(diào)查。
　　2.禽致病性大腸桿菌DE719 T6SS基因的序列分析、流行病學(xué)調(diào)查及克隆表達(dá)
　　T6SS是

6、新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌蛋白分泌系統(tǒng)，其在APEC中的作用尚待研究。本研究根據(jù)NMEC RS218的T6SS序列對(duì)APEC DE719的T6SS進(jìn)行了測(cè)序，并檢測(cè)了核心基因dotU在75株APEC分離株中的分布。另外，對(duì)核心蛋白DotU、Hcp1和Hcp2進(jìn)行克隆表達(dá)，并制備相應(yīng)抗血清，為進(jìn)一步研究DotU在APEC致病力以及蛋白分泌過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。分析發(fā)現(xiàn)DE719 T6SS大小為23033 bp，結(jié)構(gòu)與新報(bào)道的APEC T6SS2相似，故

7、命名為DE719 T6SS2，其核心基因dotU的分布率為6.67％。另外，設(shè)計(jì)合成dotU、hcp1、hcp2的特異性表達(dá)引物，并進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)雙酶切定向克隆于原核表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，構(gòu)建相應(yīng)表達(dá)菌BL21-pET28a-dotU、BL21-pET28a-hcp1、BL21-pET30a-hep2。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)了大小依次為32 kD、23 kD和26 kD的融合蛋白。免疫新西蘭大白兔獲得相應(yīng)多克隆抗

8、體，經(jīng)間接ELISA和Western blot鑒定，均具有較高的效價(jià)和良好的特異性。同時(shí)，通過(guò)間接ELISA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DE719鴨康復(fù)血清中含有抗DotU抗體，說(shuō)明DotU在感染過(guò)程中表達(dá)，并可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，提示DotU可能在DE719的致病過(guò)程中發(fā)揮一定作用。
　　3.禽致病性大腸桿菌DE719 T6SS2基因缺失株、互補(bǔ)株的構(gòu)建及特性分析
　　為研究T6SS2核心蛋白DotU在APEC DE719致病過(guò)程中的作用，

9、本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了DE719的dotU、hcp1、hcp2缺失株及T6SS2缺失株，并用pSTV28構(gòu)建了dotU缺失互補(bǔ)株。通過(guò)一系列試驗(yàn)比較分析野生株、基因缺失株和互補(bǔ)株的生物學(xué)特性、致病力差異，同時(shí)還探究了dotU缺失對(duì)T6SS2蛋白分泌(Hcp1和Hcp2)的影響。生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生株相比，dotU缺失株的生長(zhǎng)特性、運(yùn)動(dòng)性無(wú)顯著變化;但其凝集沉降能力、對(duì)環(huán)境及SPF雞血清耐受力顯著下降。細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯

10、示，dotU缺失導(dǎo)致其對(duì)DF-1的黏附能力、對(duì)HD-11的抗吞噬能力和胞內(nèi)存活能力顯著下降。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明DE719△dotU對(duì)雛鴨的致病力、體內(nèi)存活和定殖能力顯著降低。對(duì)T6SS2分泌蛋白的分析發(fā)現(xiàn)dotU的缺失沒(méi)有影響Hcp1的表達(dá)，但導(dǎo)致APEC不能向胞外分泌Hcp1。在野生株、dotU缺失株和互補(bǔ)株的培養(yǎng)基上清中均未檢測(cè)到Hcp2。另外，對(duì)全菌感染的HD-11細(xì)胞進(jìn)行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)dotU缺失株組的IL-6和IL-8顯著下調(diào)