Tspan5在胃癌中的表達及調節(jié)胃癌細胞增殖機制的研究.pdf

1、胃癌(Gastric Carcinoma，GC)是位于第四位人類最常見腫瘤，也是腫瘤相關性死亡最常見的原因之一。在2008年，全球總共有989，600新增胃癌病例和738，000例胃癌估計死亡率，占全球癌癥病例總數的8％和估計癌癥死亡總人數的10％。而胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)是在亞洲東部，東歐和南美。近年來，隨著診斷技術的進步及針對腫瘤的外科手術和放化療治療策略的成熟，但由于胃癌的復發(fā)、轉移，患者的預后仍然并不令人十分滿意。此外，盡管TNM

2、(tumor-node-metastasis)臨床分期是使用最廣泛的分期系統(tǒng)，并對胃癌患者的預后有提示意義，但它依舊是很難獲得患者其它相對具體的臨床預后信息。因此，發(fā)展對患者預后進行評估預測的新的生物標志物，對于目前來說是非常迫切需要的。而且胃癌相關基因及其蛋白分子不僅在了解胃癌的發(fā)病機制方面十分重要，在臨床靶向性治療和改善預后等方面也意義重大。
　　Tspan5(tetraspanin5，net4，TMS4SF9)，屬于四分子交

3、聯(lián)體超家族(tetraspanin)中的一員。Tetraspanin是四次跨膜的小分子細胞膜蛋白(20-50kDa)，其特點是有四個比較保守的跨膜域(TM)。TM延伸到細胞膜外，形成一個小的胞外環(huán)和一個大的胞外環(huán)，而在胞內則形成一個很短的氨基末端和一個羧基末端。Tetraspanin可以與其他同是Tetraspanin成員的細胞跨膜受體蛋白通過相互作用形成復合物，此復合物被稱為富含tetraspanin的胞膜微結構域。在人類tetras

4、panin家族中已有33的成員被發(fā)現(xiàn)，但只有少數關于該家族成員在哺乳動物細胞上進行研究。有幾項研究分別揭示在tetraspanin家族中，例如 TSPAN1(NET-1)、TSPAN13(NET-6)、 TSPAN24(CD151)、 TSPAN27(CD82)、 TSPAN28和TSPAN29(CD9)，表明他們在某些人類癌癥中下調或表達升高，這意味著這些tetraspanin成員可能參與腫瘤發(fā)生或腫瘤的進展惡化。而相比之下，關于Ts

5、pan5在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移作用方面則所知甚少。
　　我們都知道惡性腫瘤的特點是無限增殖，其無限增殖多與細胞周期和細胞凋亡障礙密切相關。細胞周期進程的失調被認為在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。大量的研究表明，細胞周期失調在腫瘤復發(fā)及進展方面負有很大的責任。在本文中，我們旨在研究Tspan5在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用及其臨床意義。此外，我們對Tspan5和胃癌細胞周期蛋白變化之間的關系非常感興趣，希望可以揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，發(fā)展

6、新的治療方法和預測疾病預后的生物標志物。
　　目的:
　　1.明確Tspan5在臨床胃癌組織標本中的表達情況，與胃癌患者病情發(fā)展、預后的關系。
　　2.探討Tspan5在影響胃癌細胞增殖、生長方面的生物學作用。
　　3.在體內外探討Tspan5對胃癌細胞周期的影響及其相關機制。
　　4.探討Tspan5在影響胃癌細胞侵襲轉移方面的生物學作用。
　　方法:
　　1.采用組織免疫化學染色的方法在11

7、4例臨床胃癌組織標本中，分析Tspan5的表達量與臨床胃癌發(fā)展、預后的關系。
　　2.基于基因克隆技術，將Tspan5片段克隆到逆轉錄病毒表達質粒plncx2-GFP-IRES中，經酶切、測序鑒定正確無誤后，與pVSV-G共轉染至GP2-293細胞中進行病毒包裝。將包裝的高表達逆轉錄病毒感染胃癌AGS和MKN45細胞，而后經G418初步篩選形成穩(wěn)定株，然后經Western blot鑒定后，擴大培養(yǎng)、凍存穩(wěn)定細胞株。
　　3.

8、CCK-8法檢測穩(wěn)定高表達Tspan5的重組細胞的增殖生長情況，同時用平板克隆形成實驗檢測重組細胞在體外克隆形成的能力，然后將重組胃癌細胞在裸鼠皮下接種成瘤，觀察其在裸鼠體內的成瘤能力。
　　4.通過流式細胞術分析Tspan5對胃癌AGS和MKN45細胞周期的影響。同時，通過蛋白電泳及瘤體組織片免疫組化對重組胃癌細胞周期蛋白分子CyclinD1、CDK4、p15、p27、E2F1和pRB的變化進行驗證。
　　5.細胞趨化運動

9、和侵襲轉移實驗，劃痕實驗分析Tspan5在重組胃癌AGS和MKN45細胞在體外的轉移能力所起的作用。
　　結果:
　　1.在114例臨床標本中，通過免疫組化染色顯示，Tspan5低表達于胃癌組織而高表達于相應癌旁組織。在癌組織中，Tspan5的表達量的高低與腫瘤大小、腫瘤侵襲程度、腫瘤淋巴結轉移和臨床TNM分期密切相關。隨著TNM分期程度的升高，Tspan5表達量逐漸降低。在生存期分析中，低表達Tspan5癌組織的患者，與高

10、表達Tspan5癌組織的患者相比，其中位生存時間和生存率均顯著下降。
　　2.逆轉錄病毒表達載體plncx2-GFP-IRES/Tspan5經酶切和測序鑒定構建成功，并與pVSV-G在GP2-293細胞中包裝得到了高表達Tspan5的逆轉錄病毒。該病毒感染的胃癌AGS和MKN45細胞經高濃度G418篩選得到了穩(wěn)定的重組細胞株。重組細胞株經Western blot實驗證實構建成功。
　　3.CCK-8實驗中高表達Tspan5的

11、胃癌AGS和MKN45重組細胞株，體外生長速度明顯慢于對照細胞(AGS-RV和MKN45-RV);平板克隆實驗顯示高表達Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細胞株的體外克隆生長能力明顯弱于對照細胞，克隆形成的大小也小于對照組細胞，差異具有統(tǒng)計意義。裸鼠皮下成瘤實驗也顯示了高表達Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細胞株的皮下成瘤速度及大小均明顯弱于對照組細胞（AGS-RV和MKN45-RV），差異具有統(tǒng)計意義。
　　4.我

12、們也進一步證明Tspan5在從細胞周期G1期到S期的過渡階段進行調控，是通過增加p15/p27蛋白的表達，同時減少細胞周期蛋白Cyclin D1/CDK4/E2F1/p-RB的表達而實現(xiàn)的。
　　5.我們在高表達Tspan5的重組胃癌細胞株中，通過轉染pCMV-Myc-CDK4，重新高表達其CDK4蛋白量，并通過蛋白電泳證實上調成功。48小時后，我們使用CCK-8分析評估該重新高表達CDK4的細胞的增殖能力情況。我們發(fā)現(xiàn)在胃癌AG

13、S或MNK45細胞中，轉染了質粒pCMV-Myc-CDK4的高表達Tspan5的細胞與轉染空載質粒pCMV-Myc的高表達Tspan5的細胞相比，其增殖能力顯著升高，并較對照組（control組）的增殖能力升高。同樣，轉染表達質粒pENTER-Cyclin D1后，其增殖能力也顯著增加，并較對照組（control組）增殖能力也升高。這表明Tspan5抑制胃癌細胞的增殖是通過控制細胞周期從G1期到S期的過渡階段，通過下調Cyclin D1

14、和CDK4蛋白表達量而實現(xiàn)的。
　　6.細胞趨化運動和侵襲轉移運動(transwell)實驗表明，Tspan5顯著抑制了胃癌AGS和MKN45細胞的侵襲轉移能力。與transwell的實驗結果一致，劃痕實驗也得到了類似的結果。因此，以上結果表明，Tspan5可能可作為抑制胃癌細胞的侵襲轉移的抑癌基因。
　　結論:
　　在臨床胃癌組織中，Tspan5低表達于癌組織而高表達于相應癌旁組織,Tspan5的表達量的高低與腫瘤大

15、小、腫瘤侵襲程度、腫瘤淋巴結轉移和臨床TNM分期密切相關。隨著TNM分期程度的升高，Tspan5表達量逐漸降低。在生存期分析中，低表達Tspan5癌組織的患者，與高表達Tspan5癌組織的患者相比，其中位生存時間和生存率均顯著下降。以上提示Tspan5可能是一個新的胃癌抑制分子。通過基因克隆技術、逆轉錄病毒包裝技術和蛋白電泳驗證，我們成功構建了穩(wěn)定高表達Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細胞株。通過CCK-8實驗和平板克隆形成實驗

16、證實高表達Tspan5抑制胃癌AGS和MKN45重組細胞的體外增殖和生長。裸鼠皮下成瘤實驗顯示高表達Tspan5抑制胃癌AGS細胞的成瘤能力。高表達Tspan5可以抑制胃癌AGS和MKN45重組細胞由G1期到S期的進程，其分子機制是下調Cyclin D1、CDK4、pRB和E2F1蛋白分子的表達和上調抑癌因子p27和p15的表達。同時在裸鼠的移植瘤的免疫組化中，CyclinD1，CDK4，E2Fl，pRb，p27和p15這四種分子的變化