花椰菜胚性愈傷組織cDNA-AFLP分析及EF-1α和LEC1 cDNA克隆.pdf

1、通過體細胞胚胎途徑再生苗可以快速繁殖種苗，為遺傳變異、基因工程提供良好受體環(huán)境。本試驗建立了花椰菜植株再生技術(shù)體系，利用cDNA-AFLP技術(shù)，對花椰菜松散型胚性愈傷組織和緊密型胚性愈傷組織差異基因進行分析，克隆了花椰菜胚性愈傷組織 EF-1α、LEC1基因，以期為體細胞胚胎分子機制的研究提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、花椰菜體胚發(fā)生植株再生的研究
　　本試驗以‘臺灣慶農(nóng)65天’種子為材料，研究不同濃度的2,4-D和N

2、AA對花椰菜胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并篩選出花椰菜胚性愈傷組織最佳增殖培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基。結(jié)果得出：以5d苗齡子葉、切成不帶葉脈方塊于MS+0.5mg/L2,4-D+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的胚性愈傷組織率最高，達97.3%，最佳增殖培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L2,4-D+3%蔗糖+0.6%瓊脂，最佳體胚成熟培養(yǎng)基：1/2MS+0.1 mg·L-1IBA，誘導(dǎo)體胚萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L

3、6-BA+0.5 mg·L-1IAA，達32.6%。
　　2、利用cDNA-AFLP技術(shù)分析花椰菜胚性愈傷組織差異表達基因
　　以花椰菜松散型胚性愈傷組織和緊密型胚性愈傷組織為材料，利用cDNA-AFLP標(biāo)記技術(shù)對體胚發(fā)育相關(guān)基因進行了差異表達分析。對 cDNA-AFLP技術(shù)中選擇性擴體系進行優(yōu)化，獲得了20μL最佳選擴體系：模板cDNA為30ng、dNTP為300μmol/L、引物為0.5μmol/L、Ex taq酶0.5

4、U、10×Buffer為2μL。
　　利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對選擇性擴增產(chǎn)物進行分離，結(jié)果獲得了43條陽性TDFs，與其他物種相關(guān)基因同源性較高，功能分別涉及細胞增殖、能量代謝、翻譯因子、逆境響應(yīng)、基因沉默、酶催化調(diào)控，激素應(yīng)答，抗氧化還原等方面。
　　3、花椰菜胚性愈傷組織EF-1α的克隆
　　從 cDNA-AFLP分析中獲得 EF-1α片段，利用 RACE技術(shù)克隆花椰菜胚性愈傷組織EF-1αcDNA，全長1705b

5、p（登錄號為 KC508634），共編碼449個氨基酸，與油菜（FJ529180.1）、擬南芥（NM10066613）、薔薇（JN399225.1）、煙草（D63396.1）、荔枝（DQ471426.1）的同源性分別為95%、91%、89%、88%、87%。通過生物信息學(xué)分析，推測花椰菜胚性愈傷組織 EF-1α編碼的蛋白為穩(wěn)定、親水性、非分泌蛋白。其編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由22.72%α螺旋、31.40%β-折疊和45.88%的不規(guī)則卷

6、曲組成，三維結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β-折疊為主，有少量的不規(guī)則卷曲，與參考蛋白序列對比一致性為74.21%。
　　4、花椰菜胚性愈傷組織的LEC1的克隆
　　利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從花椰菜緊密型胚性愈傷組織中克隆了LEC1 cDNA，該cDNA全長926bp（登錄號為KC541558），編碼239個氨基酸，與油菜（EU371726.1）、擬南芥（NM102046.4）、龍眼（GU584089.2）、玉米（NM00111