利用DNA家族改組技術(shù)創(chuàng)制植物強(qiáng)耐鹽Na+-H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因.pdf

1、土壤鹽漬化是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的重要非生物脅迫因素。為了避免Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用，植物特別是鹽生植物抵御鹽脅迫的有效策略之一就是通過液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na+區(qū)域化到液泡中。同時(shí)，Na+又可作為一種有益的滲透調(diào)節(jié)劑來降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，從而使植物能更好的適應(yīng)鹽漬環(huán)境。在不同植物中過量表達(dá)液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因均可顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，說明液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種重要的

2、耐鹽決定因子。然而，目前已克隆的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在轉(zhuǎn)運(yùn)活性相對(duì)較低，耐鹽性不高的問題。因此，對(duì)已有比較耐鹽的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行改造，然后將此耐鹽基因轉(zhuǎn)入到作物中，進(jìn)而培育耐鹽新品種對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大實(shí)踐意義。
　　DNA家族改組（DNA family Shuffling）技術(shù)是一種應(yīng)用于酶、蛋白質(zhì)和單克隆抗體等體外定向進(jìn)化的快速高效的分子生物學(xué)方法，該技術(shù)在提高酶活性和穩(wěn)定性以及改變底物特異性等方面

3、具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究以鹽生植物堿蓬和鹽角草的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（SsNHX1和SeNHX1）為模板，利用DNA family shuffling技術(shù)進(jìn)行定向進(jìn)化，并結(jié)合酵母突變體表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行篩選，成功獲得了一個(gè)新的耐鹽性顯著增強(qiáng)的改組基因，命名為SseNHX1。序列比較分析發(fā)現(xiàn)，SseNHX1較親本SsNHX1有14個(gè)氨基酸的突變，其中有12個(gè)突變的氨基酸來自于另一親本SeNHX1序列。
　　酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)

4、顯示，SseNHX1表達(dá)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白較 SsNHX1和SeNHX1基因的表達(dá)產(chǎn)物耐NaCl能力分別提高了1.4和1.2倍。與親本基因比較，表達(dá)SseNHX1的酵母轉(zhuǎn)化子液泡中富集更多的Na+，表明其耐鹽性的增強(qiáng)是通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)來實(shí)現(xiàn)的。此外，轉(zhuǎn)SseNHX1基因的酵母轉(zhuǎn)化子也提高了對(duì)LiCl的耐受性，而對(duì)KCl和潮霉素的耐受性與兩個(gè)親本基因基本類似，表明突變位點(diǎn)的出現(xiàn)并沒有導(dǎo)致該蛋白活性對(duì)其他陽離子耐受性的變化。將GFP基因

5、融合到 SseNHX1的C末端，在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。激光共聚焦結(jié)果顯示，SseNHX1表達(dá)的蛋白主要定位于液泡膜上。
　　為了驗(yàn)證改組基因SseNHX1對(duì)植物耐鹽性的影響，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，將SseNHX1和SsNHX1、SeNHX1基因分別轉(zhuǎn)入煙草中。半定量PCR分析表明不同的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在轉(zhuǎn)基因煙草中均可正常表達(dá)。在對(duì)SseNHX1基因的耐鹽性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在200 mM和300 mM NaC