桃蔗糖轉運蛋白基因的功能驗證與PpSUT2蛋白表達分析.pdf

1、桃（Prunus Persica(L.)Batsch.）因其營養(yǎng)豐富、風味獨特在園藝產業(yè)中占據重要地位。桃果實的品質受多種因素影響，如光合產物的轉化和積累。蔗糖作為碳水化合物的主要存在形式，在源葉合成后經過韌皮部的運輸到達各庫器官，如果實中。桃果實的品質和產量很大程度上取決于所含碳水化合物的種類和數量。蔗糖轉運蛋白作為碳水化合物裝載進韌皮部，且從合成部位運輸到有需求組織部位的主要介質，負責蔗糖的裝載、卸載和分配。通過研究蔗糖轉運蛋白的作

2、用機制，可以幫助理解決定果實生長和品質的蔗糖積累的過程。因此，對植物蔗糖轉運蛋白的深入探索研究是很有必要的。該試驗在本課題組的研究基礎上，從桃中克隆出桃蔗糖轉運蛋白家族的3個成員PpSUT1，PpSUT2和PpSUT4，利用缺陷型酵母對其進行功能驗證，通過對PpSUT2進行原核表達，制備了多克隆抗體，并對桃各組織中PpSUT2的蛋白表達進行分析，為基因的免疫細胞定位、蛋白質互作因子等研究提供了重要依據。主要作了如下幾項研究：
　　

3、1．桃SUTs的克隆和序列分析
　　從桃中克隆出其蔗糖轉運蛋白家族基因PpSUT1（KU230443），PpSUT2（KJ152144）和PpSUT4（KU198999）分別與桃基因組序列ppa004033m，ppa003041m和ppa004620m相一致。此處得到的PpSUT2基因含有長度為1830bp的ORF，比此前克隆的PpSUT2（1782bp）多出47個堿基，編碼長度為609個氨基酸的蛋白質。
　　2．桃SUTs

4、在酵母中的功能分析
　　通過構建酵母表達載體，將桃的3個SUT基因在具有蔗糖吸收缺陷的酵母菌株SUSY7/ura3中進行異源表達，PpSUT1、PpSUT2和PpSUT4在SD-蔗糖培養(yǎng)基上都表現出了功能的互補，表明這3個桃蔗糖運蛋白基因都分別編碼一個具有蔗糖轉運活性的功能性蛋白。
　　3．桃PpSUT2的原核表達及抗體制備
　　根據PpSUT2基因的ORF序列，構建pET32a-PpSUT2重組質粒，在表達菌株大腸桿

5、菌BL21(DE3)PlysS中經IPTG誘導表達，所得到融合蛋白的分子量約為84kD。以純化的PpSUT2-His蛋白為抗原進行兔免疫，用間接ELISA對抗血清進行效價檢測，其效價達到了1:12800，Western blot分析顯示該抗體能特異性識別PpSUT2融合蛋白，表明制備的PpSUT2多克隆抗體具有較高的檢測靈敏度和特異性。
　　4．桃PpSUT2的蛋白組織特異性表達
　　提取桃不同組織的總蛋白，進行Wester