小分子化合物對(duì)核酸的識(shí)別以及調(diào)控作用的研究.pdf

1、核酸是重要的生物遺傳大分子，在分子層次上的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解，有利于我們利用小分子化合物對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和調(diào)控。
　　 目前科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了約20種與三連子重復(fù)序列非正常擴(kuò)增相關(guān)的人類遺傳性紊亂，我們利用DNA體外復(fù)制技術(shù)，研究了與三連子重復(fù)序列滑移相關(guān)的凸起結(jié)構(gòu)具有特異性識(shí)別功能的一系列新制癌菌素發(fā)色團(tuán)類似物對(duì)體外DNA滑移合成的刺激效應(yīng)。
　　 氨基糖取代的新制癌菌素類似物(化合物1和2)對(duì)ATT滑移合成的表現(xiàn)出明顯的劑量依

2、賴性和時(shí)間效應(yīng)。在相同濃度下，化合物的刺激效果明顯好于化合物2的。二者刺激作用的差異可能來自于嵌插時(shí)的方式和程度不同。將化合物1和2對(duì)其他幾種二連子和三連子重復(fù)序列在DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段催化下的滑移合成進(jìn)行了探討。具有較不穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列均比具有形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列束滑出的產(chǎn)物更長(zhǎng)。在1和2存在下，所有序列的滑移合成被大大促進(jìn)。對(duì)具有較不穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)序列的促進(jìn)程度明顯強(qiáng)于形成相對(duì)穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列。同時(shí)驗(yàn)證了不同重復(fù)

3、序列的模板在滑移過程中的狀態(tài)以及化合物1和2影響。觀察到了與引物延伸反應(yīng)中相似的現(xiàn)象，即具有較不穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，均比具有形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列束滑出的產(chǎn)物更長(zhǎng)；加入1和2之后，所有序列的滑移合成被大大促進(jìn)，對(duì)具有較不穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)序列的促進(jìn)程度明顯強(qiáng)于形成相對(duì)穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列。這些結(jié)果意味著模板延伸和引物延伸是相互依賴的，并且是同步發(fā)生的。接著我們驗(yàn)證了一系列的具備或者不具備3’-5’外切酶活性的原核生物的DNA聚合酶對(duì)藥物誘導(dǎo)

4、的ATT滑移合成的影響。根據(jù)這些DNA聚合酶自身的聚合酶活性以及外切酶活性的差異對(duì)比，對(duì)所得到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行了詳細(xì)分析。
　　 非對(duì)映異構(gòu)體12和13是將氨基糖從螺環(huán)骨架的第21位轉(zhuǎn)移到第13位后的產(chǎn)物，它們的加入明顯刺激三連子ATT的體外合成，并表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴性。將幾個(gè)簡(jiǎn)單的氨基糖連接在糖苷配基骨架上，發(fā)現(xiàn)亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸的新制癌菌素類似物對(duì)ATT滑移合成的影響不明顯，但是，脯氨酸的新制癌菌素類似物(10和

5、11)使ATT的滑移明顯受到了抑制，并隨著脯氨酸取代物濃度的升高，抑制效果越好，同時(shí)也表現(xiàn)了明顯的時(shí)間曲線。
　　 根據(jù)滑移以及藥物刺激的結(jié)果，從所得到的DNA產(chǎn)物觀察，在合成過程中必然涉及了重復(fù)序列自身的滑移合成。而且，滑移在雙鏈的2條鏈上同步發(fā)生?；坪铣杀患尤氲?和2、12和13大大加強(qiáng)了，而被10和11所抑制，由于這些化合物對(duì)凸起DNA具有優(yōu)先結(jié)合性，因而推測(cè)出它們對(duì)滑移過程的具有調(diào)控功能。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件，

6、包括反應(yīng)溫度、孵育時(shí)間、寡核苷酸與聚合酶加入量的比例等等進(jìn)行了詳盡的分析。最后，對(duì)三連子重復(fù)序列的滑移合成以及小分子調(diào)控的可能機(jī)制進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕忉尅?br>　　 與此同時(shí)，利用圓二色譜研究了這一系列制癌菌素類似物對(duì)凸起結(jié)構(gòu)DNA的特異性識(shí)別作用。化合物1和2、4和5的加入，未能引起發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡核苷酸發(fā)生構(gòu)象變化，但是對(duì)于包含簡(jiǎn)單凸起結(jié)構(gòu)(1～3個(gè)堿基凸起)寡核苷酸，減去藥物的DNA譜圖與天然DNA的信號(hào)相比發(fā)生了較大的改變。說明這些化

7、合物的加入誘導(dǎo)含有凸起結(jié)構(gòu)DNA構(gòu)象發(fā)生了較大的變化，而這種結(jié)合是針對(duì)凸起結(jié)構(gòu)特異性的。顯示在藥物改變凸起結(jié)構(gòu)DNA的構(gòu)象識(shí)別過程中遵循一種“誘導(dǎo)性適應(yīng)”的機(jī)理。
　　 為了研究與疾病相關(guān)的三連子重復(fù)序列的DNA滑移機(jī)理以及利用小分子化合物對(duì)體內(nèi)滑移過程進(jìn)行調(diào)控，我們構(gòu)建了一系列包含不同重復(fù)基因、不同長(zhǎng)度的質(zhì)粒。目前已經(jīng)得到了多個(gè)種類的幾十個(gè)克隆，為今后的實(shí)驗(yàn)墊定了基礎(chǔ)。
　　 以包含不同重復(fù)基因、不同長(zhǎng)度的質(zhì)粒為模板應(yīng)

8、用于不同的DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)體系。Taq和pfu DNA聚合酶能夠完全擴(kuò)增不能形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板，而低保真度的Taq DNA聚合酶不能通讀包含長(zhǎng)的(CTG)n·(CAG)n(n≥46)的重復(fù)束，得到的是刪減PCR產(chǎn)物。PCR刪減產(chǎn)物中剩余的三連子重復(fù)序列的數(shù)目幾乎都在10～40個(gè)之間。另一方面，具有校對(duì)功能的pfu DNA聚合酶能夠通讀長(zhǎng)的、位于質(zhì)粒先導(dǎo)鏈的(CAG)n序列的模板(n≥46)，只能部分通讀長(zhǎng)的、位于質(zhì)粒先導(dǎo)鏈的(C

9、TG)n序列的模板。這種差異是由于(CTG)n重復(fù)形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)比(CAG)n更穩(wěn)定。當(dāng)在擴(kuò)增體系中加入水溶性的亞砜分子如甲基亞砜、二乙基亞砜、正丁基亞砜、呋喃基亞砜，均可在某種程度上協(xié)助Taq和pfu DNA聚合酶通讀這些復(fù)雜的DNA序列。亞砜的加入使分別由(CTG)n和(CAG)n形成的滑出發(fā)卡結(jié)構(gòu)和隨機(jī)盤繞構(gòu)型變得不穩(wěn)定，促使這些結(jié)構(gòu)在展開后重新與它們的互補(bǔ)鏈退火，成功地協(xié)助了DNA聚合酶，使包含高GC含量的三連子重復(fù)序列的模板得

10、以完整擴(kuò)增。
　　 類胡蘿卜素是強(qiáng)抗氧化劑，可以高效地猝滅單線態(tài)氧；但在一定條件下卻表現(xiàn)出促氧化作用。銅離子是染色質(zhì)上重要的結(jié)構(gòu)金屬離子，具有較高的氧化-還原電勢(shì)。為了深入研究類胡蘿卜素化合物-norbixin和methylbixin在癌癥預(yù)防和抗氧化的性質(zhì)，對(duì)它們?cè)阢~離子誘導(dǎo)DNA損傷過程中的毒性和抗氧化性進(jìn)行了評(píng)估。發(fā)現(xiàn)胭脂樹橙本身對(duì)超螺旋DNA沒有明顯的損傷作用。但是，與銅離子的混合后造成缺口型DNA的比例明顯增加，這2種