RNA干擾抑制馬立克氏病毒繁殖的研究.pdf

1、　　本文針對(duì)MDV-1RBIB株UL49基因序列(編碼被膜蛋白VP22)尋找siRNA靶序列，根據(jù)siRNA陰性對(duì)照設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的陰性對(duì)照。經(jīng)BLAST驗(yàn)證，所選擇的靶序列與雞體和其他病毒基因片段無同源性。在設(shè)計(jì)的靶序列5'端開始的19個(gè)核苷酸為正義鏈，中間加入9個(gè)核苷酸TTCAAGAGA的間隔以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3'端加有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TTTTTT。并且5'端帶有BamHⅠ(GATCC)酶切位點(diǎn)，3'端帶有SalⅠ(GTCGAC)和Hi

2、ndⅢ(TTCGA)酶切位點(diǎn)。靶序列分別被克隆到psilence2.0-U6載體上。經(jīng)SalⅠ酶切鑒定和測(cè)序鑒定后，證明已成功地構(gòu)建了針對(duì)UL49基因不同區(qū)域的shRNA(smallhairpinRNA)表達(dá)載體。同時(shí)根據(jù)Ambion公司已發(fā)表的針對(duì)加強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的siRNA序列構(gòu)建了相應(yīng)的陽性對(duì)照載體pu6EGFP?！　∫蕴崛〉腗DV-1RBIB株病毒基因組DNA為模板，根據(jù)GeneBank上發(fā)表的MDVMd5株UL4

3、9基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增出UL49(750bp)基因，克隆到pMD18-TSimpleVector。目的片段經(jīng)雙酶切連接到pEGFPC1載體上，構(gòu)建了pEGFP-vp22融合表達(dá)載體。經(jīng)轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，分別在24h，48h，72h觀察熒光的變化。PEGFP-vp22與構(gòu)建的針對(duì)UL49基因不同區(qū)域的shRNA表達(dá)載體分別兩兩共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞后，分別在24h，48h，72h觀察熒光的變化。在此基礎(chǔ)上以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量RT-PC

4、R(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))，在mRNA水平上來驗(yàn)證這些shRNA表達(dá)載體的有效性。　　選取能有效抑制MDV1型超強(qiáng)毒RB1B株的被膜蛋白VP22的shRNA表達(dá)載體—pu6vp22-4，通過轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞后，再接種超強(qiáng)毒RB1B株，通過蝕斑數(shù)的比較來驗(yàn)證RNA干擾(RNAinterference，RNAi)能否有效抑制MDV蝕斑的形成。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察pu6vp22-4抑制MDV蝕斑的形成的動(dòng)態(tài)效應(yīng)、劑量效應(yīng)、以及CEF細(xì)胞感染MD