人胎兒來源干細(xì)胞的心肌分化潛能研究.pdf

1、歐洲和美國(guó)現(xiàn)有1900萬兒童和成年人的心衰患者，導(dǎo)致每年23萬人的死亡和1400億美元的醫(yī)療費(fèi)用。全世界范圍內(nèi)每年有250萬先心病兒童出生，這其中許多患兒最終進(jìn)展為心衰。盡管目前臨床采用的藥物治療、介入治療及心臟外科手術(shù)治療等方法能夠在一定程度上緩解病情，但是對(duì)于有功能心肌細(xì)胞數(shù)量減少和收縮功能下降導(dǎo)致的心衰仍然沒有根治的方法。以干細(xì)胞移植為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療和組織工程治療有望修復(fù)損傷心肌或增強(qiáng)心功能，因此有望成為心衰治療的新方法，已成為再

2、生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中的熱點(diǎn)。胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及羊膜上皮細(xì)胞來自分娩后的廢棄物，組織來源豐富，在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用上無倫理學(xué)限制;并且，它們介于成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞之間，具有很低的免疫原性、很高的增殖能力以及分化能力。另外，隨著干細(xì)胞庫的發(fā)展，越來越多的人選擇保存胎兒來源的干細(xì)胞，使得胎兒來源干細(xì)胞具有在未來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。因此可知，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及羊膜上皮細(xì)胞等胎兒來源的干細(xì)胞具有應(yīng)用于心臟疾病臨床治療的巨大潛力，是短期內(nèi)

3、有望取得臨床治療突破的種子干細(xì)胞。
　　 心臟組織再生醫(yī)學(xué)需要大量的、高功能的種子干細(xì)胞，目前獲得大量干細(xì)胞的最常規(guī)方法是體外連續(xù)傳代。研究表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外連續(xù)傳代，但這種連續(xù)傳代過程改變了其成骨和成脂定向分化能力，對(duì)于心肌分化能力是否有影響目前尚不清楚。此外，體外連續(xù)傳代是否影響羊膜上皮細(xì)胞增殖特性、干性維持及向心肌分化能力還未有報(bào)道。并且，同一胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羊膜上皮細(xì)胞的上述生物學(xué)特性是否有差異

4、也鮮見研究。因此，闡明上述問題對(duì)于確定種子干細(xì)胞來源、定制干細(xì)胞體外擴(kuò)增方案及預(yù)測(cè)體內(nèi)心肌修復(fù)效果等具有十分重要的意義。
　　 目的:
　　 本研究對(duì)不同胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外連續(xù)傳代，分析傳代過程對(duì)這兩種干細(xì)胞增殖特性、干性維持以及心肌分化能力的作用規(guī)律;對(duì)同一胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羊膜上皮細(xì)胞的上述生物學(xué)特性進(jìn)行比較分析，研究?jī)烧咧g的差異與聯(lián)系;初步探索個(gè)體間差異對(duì)這兩種干細(xì)胞生物

5、學(xué)特性的影響。
　　 方法：
　　 20例臍帶與羊膜均來自大連市婦產(chǎn)醫(yī)院正常足月分娩新生兒。利用組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，利用酶消化法獲得羊膜上皮細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行相關(guān)干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定。對(duì)這兩種干細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)體外連續(xù)傳代，利用CCK-8、流式細(xì)胞儀及real-time PCR等手段檢測(cè)不同代數(shù)干細(xì)胞增殖特性、表面標(biāo)志、細(xì)胞周期、干性基因標(biāo)志物的表達(dá)情況;添加5-氮雜胞苷以及抗壞血酸磷酸鈉分別對(duì)不

6、同代數(shù)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行心肌分化誘導(dǎo)，利用real-time PCR分析心肌細(xì)胞標(biāo)志基因Nkx2.5以及GATA4的基因表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用組織塊培養(yǎng)法獲得了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞典型表面標(biāo)志物，CD73、CD90及CD105表達(dá)均在95％以上;利用優(yōu)化的二次酶消化法獲得了羊膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞呈扁平狀多角形，細(xì)胞之間排列緊密，具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，原代羊

7、膜上皮細(xì)胞表達(dá)干性標(biāo)志物SSEA-4(25％-96％)。
　　 2、隨著傳代次數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖速率逐漸降低，所具有的人胚胎干細(xì)胞干性基因Oct3/4及Nanog的表達(dá)水平逐漸降低，且其表達(dá)存在較大個(gè)體差異，所具有的中胚層標(biāo)志基因Vimentin在第7代表達(dá)最高，細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD73、CD90及CD105）表達(dá)穩(wěn)定;經(jīng)過5-氮雜胞苷體外誘導(dǎo)后，心肌標(biāo)志基因Nkx2.5隨著傳代次數(shù)增加表達(dá)水平增高，但是個(gè)體差

8、異較大。
　　 3、隨著傳代次數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞的增殖速率降低，細(xì)胞形態(tài)不均勻，某些樣本出現(xiàn)纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，羊膜上皮細(xì)胞的干性標(biāo)志物SSEA-4表達(dá)逐漸下降，說明羊膜上皮細(xì)胞在目前條件下還不能在體外連續(xù)傳代，其表型難以維持;2-3代上皮細(xì)胞經(jīng)過抗壞血酸磷酸鈉體外誘導(dǎo)后，不同樣本的心肌標(biāo)志基因Nkx2.5以及GATA4表達(dá)水平差異很大，有些樣本心肌標(biāo)志基因甚至沒有表達(dá)，這提示羊膜上皮細(xì)胞的心肌分化能力存在更大的個(gè)體差異

9、，此差異與SSEA-4表達(dá)水平不相關(guān)。
　　 4、通過將同一胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)某些樣本來源的第三代羊膜上皮細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)，其Nkx2.5表達(dá)水平相當(dāng)于第7代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)水平，GATA4表達(dá)則相當(dāng)于第14代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)水平，這說明盡管羊膜上皮細(xì)胞目前體外培養(yǎng)條件還存在問題，盡管某些樣本來源的羊膜上皮細(xì)胞不具有心肌分化能力，但是研究結(jié)果提示有些樣本來源的羊膜上皮細(xì)胞心肌分化潛能可