利拉魯肽對(duì)高糖環(huán)境下大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響及與ERK信號(hào)通路關(guān)系研究.pdf

1、目的：肝纖維化是糖尿病患者眾多合并癥之一。而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝損傷發(fā)生時(shí)生成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞來源，其在肝纖維化形成的過程中處于核心地位。鑒于HSC在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮主導(dǎo)作用，抗纖維化的研究通常將HSC作為靶標(biāo)。利拉魯肽則是一種新型的降糖藥物，類屬于人胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1， GLP-1）受體激動(dòng)劑，相關(guān)研究證明肝星狀細(xì)胞上有GLP-1

2、受體的表達(dá)。因此我們?cè)O(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)，探討利拉魯肽對(duì)高糖環(huán)境下大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響及與ERK信號(hào)通路的關(guān)系。
　　方法：
　　1.大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）的培養(yǎng)：將復(fù)蘇的細(xì)胞接種至無菌培養(yǎng)瓶中，應(yīng)用含10％胎牛血清的低糖改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM）溶液(含葡萄糖5.5mmol/L)作為培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為5%

3、的CO2飽和濕度，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.MTT法確定最適利拉魯肽濃度：HSC分為11組，分別配成以下溶液：含高糖（25.0mmol/L）以及不同濃度的利拉魯肽（0 nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L、500nmol/L、600nmol/L、700nmol/L、800nmol/L、900nmol/L），觀察48h，MTT法檢測(cè)上述11組細(xì)胞的增

4、殖情況。選取細(xì)胞增殖抑制率開始升到平臺(tái)期的利拉魯肽濃度700nmol/L作為最適宜利拉魯肽濃度。MTT法確定最適ERK抑制劑 PD98059濃度：HSC分為7組，分別配成以下溶液：含高糖（25.0mmol/L）以及不同濃度的PD98059（0 umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L、300umol/L、400umol/L），觀察48h， MTT法檢測(cè)上述7組細(xì)胞的增殖情況。選取細(xì)胞增殖抑

5、制率開始升到平臺(tái)期的PD98059濃度200 umol/L為最適宜抑制劑濃度。
　　3.分組干預(yù)：將大鼠肝星狀細(xì)胞隨機(jī)分成以下5組。即正常糖對(duì)照組（5.5mmol/L）、高糖對(duì)照組（25.0mmol/L）、高滲組（5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）、高糖+利拉魯肽組（25.0mmol/L高糖+最適利拉魯肽濃度），簡(jiǎn)稱利拉魯肽組、高糖+抑制劑組（25.0mmol/L高糖+最適宜PD98059濃度），簡(jiǎn)稱抑制劑組。

6、將5組細(xì)胞在10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行以下操作。
　　4.采用ELISA法定量測(cè)定大鼠肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)上清I型膠原含量。
　　5.RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝星狀細(xì)胞ERK mRNA的表達(dá)水平。
　　6.Western blot法檢測(cè)ERK/p-ERK蛋白表達(dá)。
　　7.數(shù)據(jù)分析：應(yīng)用Excell建立數(shù)據(jù)簿，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用單

7、因素方差分析LSD法進(jìn)行組間對(duì)比,P<0.05為有顯著意義。
　　結(jié)果：1 MTT法測(cè)定最適宜利拉魯肽濃度為700nmol/L，最適宜ERK抑制劑PD98059濃度為200 umol/L；2 I型膠原含量比較：與對(duì)照組相比，高滲組I型膠原含量無明顯變化（P＞0.05），高糖組I型膠原含量明顯增多（P<0.05），利拉魯肽組與抑制劑組較高糖組 I型膠原含量明顯減少（P<0.05），抑制劑組較利拉魯肽組I型膠原含量減少（P<0.05）

8、；3 ERK mRNA的表達(dá)水平比較：與對(duì)照組相比，高滲組ERK mRNA表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），高糖組ERK mRNA明顯表達(dá)增多（P<0.05），抑制劑組與利拉魯肽組較高糖組ERK mRNA表達(dá)明顯較少（P<0.05），抑制劑組少于利拉魯肽組（P<0.05）；4 ERK表達(dá)結(jié)果：與對(duì)照組相比，高滲組p-ERK表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），高糖組p-ERK明顯表達(dá)增多（P<0.05），利拉魯肽組與抑制劑組較高糖組p-ERK表