利拉魯肽對高糖環(huán)境下大鼠肝星狀細胞增殖的影響及與ERK信號通路關系研究.pdf

1、目的：肝纖維化是糖尿病患者眾多合并癥之一。而肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝損傷發(fā)生時生成細胞外基質(zhì)的主要細胞來源，其在肝纖維化形成的過程中處于核心地位。鑒于HSC在肝纖維化的發(fā)病機制中發(fā)揮主導作用，抗纖維化的研究通常將HSC作為靶標。利拉魯肽則是一種新型的降糖藥物，類屬于人胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1， GLP-1）受體激動劑，相關研究證明肝星狀細胞上有GLP-1

2、受體的表達。因此我們設計此實驗，探討利拉魯肽對高糖環(huán)境下大鼠肝星狀細胞增殖的影響及與ERK信號通路的關系。
　　方法：
　　1.大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）的培養(yǎng)：將復蘇的細胞接種至無菌培養(yǎng)瓶中，應用含10％胎牛血清的低糖改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM）溶液(含葡萄糖5.5mmol/L)作為培養(yǎng)液。將細胞置于體積分數(shù)為5%

3、的CO2飽和濕度，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.MTT法確定最適利拉魯肽濃度：HSC分為11組，分別配成以下溶液：含高糖（25.0mmol/L）以及不同濃度的利拉魯肽（0 nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L、500nmol/L、600nmol/L、700nmol/L、800nmol/L、900nmol/L），觀察48h，MTT法檢測上述11組細胞的增

4、殖情況。選取細胞增殖抑制率開始升到平臺期的利拉魯肽濃度700nmol/L作為最適宜利拉魯肽濃度。MTT法確定最適ERK抑制劑 PD98059濃度：HSC分為7組，分別配成以下溶液：含高糖（25.0mmol/L）以及不同濃度的PD98059（0 umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L、300umol/L、400umol/L），觀察48h， MTT法檢測上述7組細胞的增殖情況。選取細胞增殖抑

5、制率開始升到平臺期的PD98059濃度200 umol/L為最適宜抑制劑濃度。
　　3.分組干預：將大鼠肝星狀細胞隨機分成以下5組。即正常糖對照組（5.5mmol/L）、高糖對照組（25.0mmol/L）、高滲組（5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）、高糖+利拉魯肽組（25.0mmol/L高糖+最適利拉魯肽濃度），簡稱利拉魯肽組、高糖+抑制劑組（25.0mmol/L高糖+最適宜PD98059濃度），簡稱抑制劑組。

6、將5組細胞在10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48小時進行以下操作。
　　4.采用ELISA法定量測定大鼠肝星狀細胞培養(yǎng)上清I型膠原含量。
　　5.RT-PCR法檢測大鼠肝星狀細胞ERK mRNA的表達水平。
　　6.Western blot法檢測ERK/p-ERK蛋白表達。
　　7.數(shù)據(jù)分析：應用Excell建立數(shù)據(jù)簿，應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用單

7、因素方差分析LSD法進行組間對比,P<0.05為有顯著意義。
　　結果：1 MTT法測定最適宜利拉魯肽濃度為700nmol/L，最適宜ERK抑制劑PD98059濃度為200 umol/L；2 I型膠原含量比較：與對照組相比，高滲組I型膠原含量無明顯變化（P＞0.05），高糖組I型膠原含量明顯增多（P<0.05），利拉魯肽組與抑制劑組較高糖組 I型膠原含量明顯減少（P<0.05），抑制劑組較利拉魯肽組I型膠原含量減少（P<0.05）

8、；3 ERK mRNA的表達水平比較：與對照組相比，高滲組ERK mRNA表達無明顯變化（P＞0.05），高糖組ERK mRNA明顯表達增多（P<0.05），抑制劑組與利拉魯肽組較高糖組ERK mRNA表達明顯較少（P<0.05），抑制劑組少于利拉魯肽組（P<0.05）；4 ERK表達結果：與對照組相比，高滲組p-ERK表達無明顯變化（P＞0.05），高糖組p-ERK明顯表達增多（P<0.05），利拉魯肽組與抑制劑組較高糖組p-ERK表