化濁解毒方中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞ERK及PI3K-Akt信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的:肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活與活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡是肝纖維化形成的主要病理過程。肝纖維化是由于多種致病因素引起的肝細(xì)胞的損傷及肝組織的炎癥反應(yīng)，是各種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的病理基礎(chǔ)。目前臨床尚缺乏特效、無毒副作用的抗肝纖維化藥物，而中醫(yī)藥以整體調(diào)節(jié)為出發(fā)點(diǎn)，以辨證論治為指導(dǎo)，在抗肝纖維化方面具有獨(dú)特的療效和優(yōu)勢(shì)。導(dǎo)師李佃貴教授以“濁毒”理論治療多種原因引發(fā)的肝纖維化，認(rèn)為濁毒內(nèi)蘊(yùn)、肝絡(luò)瘀

2、阻是肝纖維化的基本病機(jī)，采用“化濁、解毒、調(diào)肝”為組方原則，制定了化濁解毒方，并取得較好的療效。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法，從細(xì)胞水平觀察MMP13和TIMP1mRNA、ERK、PI3K及Akt蛋白的表達(dá)，探討化濁解毒方大鼠含藥血清對(duì)ECM及HSC活化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，為化濁解毒方抗肝纖維化可能的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:選取清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體重（200±20）g。自適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為模型對(duì)照組（

3、給予生理鹽水）、陽性對(duì)照組（即復(fù)方鱉甲軟肝片組）、化濁解毒方組（分為臨床等效劑量和二倍等效劑量），各組等體積灌胃給予相應(yīng)藥物10天后，制備大鼠含藥血清。以含藥血清體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞并加入TGF-β1，培養(yǎng)48h;其中，每只模型對(duì)照組大鼠同時(shí)留取備份血清，培養(yǎng)原代的肝星狀細(xì)胞48h，作為正常對(duì)照組。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)HSC中MMP13及TIMP1mRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測(cè)p-ERK、PI3K及p-Akt蛋白的表達(dá)。

4、
　　 結(jié)果:
　　 1、RT-PCR法檢測(cè)HSC中MMP13及TIMP1mRNA的表達(dá):
　　 1.1、MMP13mRNA的表達(dá):與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組中MMP13mRNA的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、化濁解毒方二倍劑量組均可促進(jìn)MMP13mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);化濁解毒方二倍等效

5、劑量的促進(jìn)作用優(yōu)于臨床等效劑量，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 1.2、TIMP1mRNA的表達(dá):與正常對(duì)照組比較，給予TGFβ-1干預(yù)的各受試組TIMP1mRNA的表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2、Western-blot法檢測(cè)HSC中p-ERK、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá):
　　 2.1、p-ERK蛋白的表達(dá):與正常對(duì)照

6、組比較，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組p-ERK蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陽性對(duì)照組、化濁解毒方二倍等效劑量組p-ERK蛋白表達(dá)均低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?；瘽峤舛痉蕉兜刃┝拷Mp-ERK蛋白表達(dá)低于陽性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?；瘽峤舛痉蕉兜刃┝拷Mp-ERK蛋白表達(dá)低于化濁解毒方臨床等效劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

7、　　 2.2、PI3K蛋白的表達(dá):模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組與正常對(duì)照組比較，PI3K蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較，化濁解毒方二倍等效劑量組PI3K蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;化濁解毒方二倍等效劑量與陽性對(duì)照組比較PI3K蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);化濁解毒方二倍等效劑量組PI3K蛋白表達(dá)低于化濁解毒方臨床等效劑量組，差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.3、p-Akt蛋白的表達(dá):與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組p-Akt蛋白的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），化濁解毒方二倍等效劑量組p-Akt蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;陽性對(duì)照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組p-Akt蛋白表達(dá)均較模型對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中化濁解毒方二倍等效劑量組差異有顯著性(P＜0.01);化濁解毒方二

9、倍等效劑量與臨床等效劑量比較，p-Akt蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、化濁解毒方含藥血清可通過改善HSC中受抑制的MMP13表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，進(jìn)而改善ECM的沉積。
　　 2、化濁解毒方含藥血清可能通過降低HSC中p-ERK、PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)，進(jìn)而阻斷ERK及PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，起到減輕HSC活化程度的作用。
　　 3、化濁解毒方