SaeRS,Agr和SarA對(duì)金黃色葡萄主要粘附蛋白的調(diào)控.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌是一種常見病原菌，可引起多種感染。在我國(guó)流行的金黃色葡萄球菌主要是ST239型和ST5型。金黃色葡萄球菌的傳播，流行及其所致感染類型與之分泌的多種粘附蛋白密切相關(guān)，這些粘附蛋白的表達(dá)受到多種調(diào)控系統(tǒng)的控制。有研究報(bào)道，新發(fā)現(xiàn)的粘附相關(guān)蛋白sasX可以促進(jìn)ST239型和ST5型金黃色葡萄球菌在醫(yī)院的傳播。粘附蛋白的流行病學(xué)和功能研究很多，但是調(diào)控機(jī)制還不完全清楚，尤其是新發(fā)現(xiàn)的sasX蛋白，其調(diào)控機(jī)制還未見

2、報(bào)道。有研究報(bào)道葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子agr、葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)因子sarA和雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)saeR主要調(diào)節(jié)各種分泌蛋白的表達(dá)，包括粘附和毒力蛋白。我們通過(guò)基因敲除方法構(gòu)建了sarA、agrA、saeRS基因敲除突變株，對(duì)saeRS、agr和sarA對(duì)金黃色葡萄球菌主要粘附基因的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　方法：
　　首先利用PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌HS770的saeRS、sarA、agrA基因的上下游同源臂;用溫度敏感

3、型質(zhì)粒pKOR1，分別構(gòu)建沒有目的DNA的重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)大腸埃希菌DC10B的修飾，電轉(zhuǎn)進(jìn)入目的細(xì)菌HS770;經(jīng)過(guò)不斷的變溫傳代，使質(zhì)粒上的同源臂與基因組上的目的DNA發(fā)生同源重組，再用脫水四環(huán)素誘導(dǎo)ccdB基因和反義secY RNA表達(dá)，篩選saeRS、sarA、agrA的疑似突變株;經(jīng)過(guò)PCR、RT-PCR和測(cè)序鑒定得到HS770△agrA、HS770△saeRS以及HS770△sarA敲除突變株;用RT-PCR和Western-

4、blot檢測(cè)saeRS、sarA、agrA對(duì)sasX基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的影響;利用RT-PCR檢測(cè)saeRS、sarA、agrA對(duì)spa，fnbpB，sasX轉(zhuǎn)錄水平的影響;同時(shí)分別檢測(cè)野生株HS770以及HS770△saeRS、HS770△sarA、HS770△agrA敲除突變株的起始粘附能力和生物膜形成能力變化。
　　結(jié)果：
　　金黃色葡萄球菌臨床分離株HS770。PCR檢測(cè)saeRS、sarA、agrA、sasX陽(yáng)性

5、。將saeRS、sarA、agrA基因上下游DNA片段進(jìn)行連接，所得連接產(chǎn)物與質(zhì)粒pKOR1進(jìn)行B-P反應(yīng)得到pKOR1-△saeRS、pKOR1-△sarA、pKOR1△-agrA重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)HS770，發(fā)生同源重組，得到HS770△saeRS、HS770△sarA、HS770△agrA突變敲除株。用PCR、RT-PCR、測(cè)序的方法驗(yàn)證敲除成功。首先我們檢測(cè)了野生株和各個(gè)基因敲除株的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示各菌的生長(zhǎng)曲線基本相

6、似，在穩(wěn)定期后期agr突變株相對(duì)其他幾株菌生長(zhǎng)有所增快。抽取3h、6h、9h、12h野生株和各個(gè)基因敲除株的RNA， qRT-PCR檢測(cè)sasX、spa、fnbpB的轉(zhuǎn)錄水平，與野生株對(duì)比，△sarA突變株中sasX基因在3h、6h、9h、12h均上調(diào)4倍4倍32倍32倍，spa，fnbpB6h、9h、12h轉(zhuǎn)錄下調(diào);△agrA突變株中sasX基因在3h、6h、9h、12h分別升高32倍100多倍8倍以及2倍，spa，fnbpB6h、9

7、h、12h轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào);△saeRS突變株中三個(gè)基因變化不大。提取3h、6h、9h、12h野生株和三個(gè)基因敲除株的菌體蛋白用抗sasX多克隆抗體進(jìn)行Western-blod，與野生株相比△sarA突變株中3h、6h、9h、12h表達(dá)量都增高，△agrA突變株中6h表達(dá)量減少，9h、12h表達(dá)量有所增加，△sae RS突變株中基本無(wú)變化。qRT-PCR與Western-blot結(jié)果提示saeRS對(duì)sasX、 spa、fnbpB可能沒有調(diào)控

8、，agrA對(duì)sasX、 spa、fnbpB存在負(fù)調(diào)控作用，sarA對(duì)sasX存在負(fù)調(diào)控作用，對(duì)spa、fnbpB正調(diào)控作用。檢測(cè)了野生株和三個(gè)基因敲除株的起始粘附能力和生物膜形成能力:起始粘附能力基本沒有變化;sarA突變敲除株生物膜形成能力下降很多，saeRS和agrA突變株生物膜形成能力基本沒有變化。
　　結(jié)論：
　　1.基因敲除方法敲除臨床分離株HS770的saeRS、agrA、sarA基因，得到HS770△saeRS