TACI-Fc及配體BAFF的表達，純化和活性研究.pdf

1、B淋巴細胞激活因子(B cell-activation factor, BAFF)和一種誘導(dǎo)增殖配體(Aproliferation-inducing ligand，APRIL)，同屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族，并且兩者蛋白質(zhì)序列有33％的同源性。這兩種因子有兩個共同受體:穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interactor，TACI)和B細胞成熟抗原(B cellmaturation

2、 antigen，BCMA)。BAFF和APRIL參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，并成為治療藥物的靶點。本文中我們將TACI胞外區(qū)基因與人IgG的Fc片段的DNA序列進行重組，構(gòu)建畢赤酵母真核表達載體pPIC9K-TACI-Fc，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌種，得到了重組TACI-Fc融合蛋白的表達克隆，并進行誘導(dǎo)表達和純化及生物學(xué)活性的鑒定工作。該項研究取得的主要結(jié)果如下:
　　1)經(jīng)過重疊PCR成功將TACI胞外區(qū)基因與IgG的F

3、c片段進行重組，融合DNA序列與GenBank序列一致。
　　2)將TACI-Fc片段插入到畢赤酵母表達質(zhì)粒pPIC9K中，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，篩選出表達克隆。SDS-PAGE分析可見在35kD處有目的蛋白條帶。Western Bloting結(jié)果顯示該蛋白與抗TACI的單克隆抗體呈陽性反應(yīng)。
　　3)進行TACI-Fc畢赤酵母表達菌的高密度發(fā)酵工作，并經(jīng)過超濾、分子篩及proteinA蛋白親和層析等純化技術(shù)純

4、化出TACI-Fc融合蛋白。
　　4)構(gòu)建BAFF原核表達載體pET32a-BAFF，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌種Transetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，并優(yōu)化誘導(dǎo)條件，成功實現(xiàn)了BAFF的高效可溶性表達。隨后進行組氨酸蛋白親和層析將BAFF純化，得到較高純度的BAFF蛋白。
　　5)將純化的BAFF和TACI-Fc進行誘導(dǎo)Raji增殖實驗，結(jié)果顯示表達純化的BAFF可以促進Raji B淋巴瘤細胞增殖，并TACI-Fc可以減弱BA