慢病毒介導的p21-Waf1 shRNA對膀胱癌特異性溶瘤腺病毒抗膀胱癌的體外實驗研究.pdf

1、目的：在我國膀胱癌的發(fā)病率一直居于泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，傳統(tǒng)的治療手段因其腫瘤殺傷能力低和副作用大等缺點，故而治療效果遠未令人滿意。選擇復制性溶瘤腺病毒治療腫瘤是極其有前途的基因治療腫瘤的方法。為此，本課題組構建了膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A，在膀胱癌特異性啟動子UPII和增強子PSCAE的控制下，該腺病毒能夠選擇性的在膀胱癌細胞中進行復制，從而發(fā)揮裂解腫瘤細胞的效應。前期的研究證實，筆者所構建的腺病毒Ad/P

2、SCAE/UPII/E1A，特異性高，其只在膀胱癌細胞中進行復制，對于膀胱癌細胞也有一定的殺傷作用。但UPII啟動子的活性相對較低，往往會削弱腺病毒的復制，從而影響其腫瘤殺傷效應。p21/Waf1做為一個經典的細胞周期抑制蛋白，近年來確由于在腺病毒介導的基因治療中的拮抗作用而受到廣泛關注，但p21/Waf1對膀胱癌特異性溶瘤腺病毒的作用卻不得而知。因此，本研究構建了p21/Waf1shRNA的慢病毒表達載體，并建立了穩(wěn)定轉染p21/Wa

3、f1shRNA的人膀胱癌細胞株EJ和5637，檢測p21/Waf1對膀胱癌特異性溶瘤腺病毒的腫瘤殺傷效應、病毒復制、UPII啟動子的活性及誘導細胞發(fā)生凋亡的影響，并初步探討了可能的作用機制，為p21/Waf1能否作為膀胱癌基因治療的一個新靶點提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：（1）構建人p21/Waf1的慢病毒干擾載體。設計針對p21/Waf1shRNA的序列，插入含GFP的pMagic7.1載體，通過PCR和DNA測序技術對重組克

4、隆進行鑒定，將重組病毒質粒和輔助包裝質粒共轉染293T細胞進行病毒包裝，并對病毒滴度進行檢測。將表達p21/Waf1shRNA的慢病毒轉染EJ和5637細胞，以嘌呤霉素進行篩選，直到獲得穩(wěn)定轉入p21/Waf1shRNA的EJ和5637細胞，檢測穩(wěn)轉細胞中p21/Waf1的表達。（2）p21/Waf1對Ad/PSCAE/UPII/E1A腫瘤殺傷效應的影響。應用MTT比色法檢測p21/Waf1敲減后腺病毒對人膀胱癌細胞株EJ和5637體外

5、增殖效應的影響。（3）p21/Waf1對Ad/PSCAE/UPII/E1A滴度的影響。利用腺病毒滴度快速檢測法檢測p21/Waf1敲減后腺病毒滴度的變化；檢測與病毒復制密切相關的指標E1A和hexon的表達。（4）p21/Waf1對UPII啟動子活性的影響。首先檢測p21/Waf1對EJ和5637細胞中AR表達水平的影響；接下來利用脂質體轉染的方法將攜帶熒光素酶報告基因的重組質粒Rp-PSCAE-UPII-Luc分別轉染EJ和5637細

6、胞，以pCMV-β-gal作為內對照，熒光素酶報告系統(tǒng)檢測p21/Waf1敲減后UPII啟動子活性的變化。（5）p21/Waf1對Ad/PSCAE/UPII/E1A誘導凋亡的影響。利用流式細胞儀檢測p21/Waf1敲減后Ad/PSCAE/UPII/E1A對EJ和5637凋亡的影響，分析凋亡信號轉導通路相關因子的表達。
　　結果：（1）成功構建了表達p21/Waf1shRNA的重組慢病毒載體，獲得滴度為4.12×108Tu/ml的慢

7、病毒。（2）慢病毒的轉染效率均>90％，獲得穩(wěn)定轉染p21/Waf1shRNA的EJ和5637細胞，p21/Waf1shRNA能顯著降低EJ和5637細胞中p21/Waf1的表達。（3）Ad/PSCAE/UPII/E1A對p21/Waf1敲減的EJ和5637細胞增殖的抑制效應明顯增強。（4）p21/Waf1敲減的EJ和5637細胞中腺病毒的滴度顯著增強。（5）在p21/Waf1敲減的EJ和5637細胞中，腺病毒復制的相關指標E1A和he

8、xon的表達明顯上調。（6）在p21/Waf1敲減的EJ和5637細胞中AR的表達明顯上調；熒光素酶活性檢測顯示，p21/Waf1敲減后的細胞內Luc的活性顯著增強。（7）Ad/PSCAE/UPII/E1A均能誘導EJ和5637細胞發(fā)生凋亡，p21/Waf1敲減后的細胞凋亡顯著增加。（8）Ad/PSCAE/UPII/E1A可以通過上調Fas、Bax、caspase3、caspase8的表達，下調Bcl-2的表達促進EJ和5637細胞發(fā)生

9、凋亡；但EJ和5637的野生型細胞和p21/Waf1敲減的細胞相比時，在p21/Waf1敲減組中，F(xiàn)as、caspase3、caspase8的表達上調，而Bax和Bcl-2的表達與野生型細胞相比無明顯變化。
　　結論：（1）成功構建了表達p21/Waf1shRNA的重組慢病毒，且能有效感染膀胱癌細胞EJ和5637。（2）慢病毒介導的p21/Waf1shRNA能顯著降低EJ和5637細胞中p21/Waf1的表達。（3）在p21/Wa